苜蓿中华根瘤菌耐盐分子机制的研究

【摘要】：苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM分离自新疆的和田苜蓿,能够在含0.6mol/LNaCl的FY基本培养基中生长。通过构建Tn5-1063插入突变体库,从20,000多株突变株中得到8株盐敏感突变株W2、W4、W8、W10、W11、W15、W19和E4。耐盐性试验表明,它们都不能在含有0.4mol/L NaCl的FY培养基中生长,在0.3mol/L LiCl的FY培养基中不能生长;其中,W15在含有0.1mol/L LiCl的FY培养基上不能生长;W8,W10在含有0.2mol/L LiCl的FY培养基上不能生长。除W4外,其余突变株在相同渗透压下,对葡萄糖所造成的渗透压不敏感,只对盐造成的渗透压敏感,进一步证明它们是盐敏感而非渗透压敏感,同时对温度和pH的耐受性没有改变。 以转座子内的基因luxAB为探针进行Southern杂交,发现Tn5在这8个突变株中都只有单一拷贝的插入,表明突变株的盐敏感表型是由于转座子插入诱变造成的。对Tn5插入位点侧翼序列进行克隆、测序,得到7个与耐盐有关基因,在Genbank的登录号为AY502026-AY502032。经分析,在W2中,Tn5插入在染色体基因greA中,此基因编码细菌转录切割因子;在W4中,Tn5插入在基因omp10内部,该基因编码细菌外膜蛋白:在W11中,Tn5插入在基因relA内部,该基因编码鸟苷五磷酸合成酶;在W15中,Tn5插入在基因nuoL内部,此基因编码NADH呼吸链L亚基蛋白;在W19中,Tn5插入在编码核酸酶、解旋酶基因的内部,该基因与DNA的复制和修复有关;在W8和W10中,Tn5插入在基因SMc02759内部,该基因功能未知:在E4中,Tn5插入在基因SMc00709内部,基因功能未知。 根据W2测序结果,PCR扩增得到包含greA基因启动子的全长区段,将其克隆至穿梭载体pBBR1MCS-5上,三亲本杂交将完整的greA基因转入突变株W2中,使突变株恢复耐盐性,证明greA基因是一种与耐盐有关的转录切割因子基因。 根据W11测序结果,PCR克隆了relA基因ORF,克隆到表达载体pET—28a,并转入E.coli的relA突变株中,实验表明,该基因有效地恢复了E.coli的relA突变株在选择性培养基上的生长,而空载体的对照则无法生长,从而有力地证明了relA基因的功能。同时,结瘤实验表明,relA基因的突变导致了042BM的结瘤缺陷。PCR扩增得到包含启动子的relA基因全长,将其克隆至穿梭载体pBBR1MCS-5上。三亲本杂交将完整的relA基因转入突变株W11中,使突变株恢复耐盐性,进一步表明relA基因是一种重要的与耐盐有关的基因。 根据实验结果,我们认为,S.meliloti 042BM的耐盐性涉及到:1)全细胞调控水平;2)大分子(如DNA)代谢水平;3)某些与抗逆有关的特殊物质的合成;4)能量代谢及离子转运系统;5)维持细胞整体结构的水平,反映出多基因的网络调控机制。