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用光镊研究微管系统的分子力学特征

徐春华  
【摘要】:微管是普遍存在于真核细胞中的一种重要的蛋白骨架,它最重要的功能之一是产生机械力推动细胞的各种形式的运动,对其力学性质的研究有助于理解和阐明其功能及机制。由于光镊可实现对生物活体样品的非实体接触和无损伤操作,且可测定生物大分子间纳米量级的微小位移和皮牛顿量级的作用力,近年来已广泛应用于生物学领域。本课题应用双光镊技术研究微管系统的分子力学特征,包括荧光标记微管断裂力的测量、微管光敏断裂过程的研究、微管弹性的研究、微管光敏断裂机理的研究及微管蛋白与微管相互作用力的研究。 首先建立了适用于光镊操作的微管系统。微管蛋白从猪脑中提取,纯化后用荧光染料罗丹明和生物素标记。标记好的微管蛋白在体外聚合成分散的单根微管,经紫杉醇稳定后稀释到所需浓度。 在实验过程中发现荧光标记的微管在激发光下会发生断裂,为了解决这个问题,对微管的光敏断裂机理进行了较深入的研究。实验结果表明,激发光和染料分子的同时存在是微管断裂的必要条件,激发光越强,染料浓度越高,微管断裂越快。激发光与染料相互作用,释放出的活性氧导致微管断裂,活性氧中的自由基是主要的破坏因子。抗坏血酸可以有效地减缓微管断裂。 建立起连接生物体系与光镊系统的相关实验系统,主要包括样品小池的制作和小球的包被。我们制作了多种样品池,以适合不同实验条件的需要。此外,还制作了流动样品池和温控流动样品池,适合需要更换溶液和准确控制样品温度的实验.经过摸索,确定了以抗生物素包被的小球作为光镊操作微管的手柄。 在用光镊拉伸荧光标记微管的过程中发现微管平均可以伸长20%。在此之后微管“台阶式”断裂过程中,也观察到剩余微管原丝的伸长。此实验直接显示了微管的弹性性质。荧光标记微管的persistence length也比正常微管小3个数量级。荧光标记微管的弹性变化与紫杉醇有关,也与激发光的破坏作用有关。通过对拉断微管的力的统计发现,力的大小主要分布在3 pN左右,大大小于拉断未经荧光标记的微管的力。激发光的破坏使微管蛋白亚基间的作用力大大减弱。 在微管的光敏断裂过程中出现了“台阶式”断裂现象。组成微管的原丝不是同时断裂而是相继断裂,最后造成整个微管的断裂。说明各微管原丝受活性氧攻击不是均匀的而是相互独立的,也说明了此状态下的微管原丝之间的相互作用力很弱。 此外,我们还测定了微管结合蛋白AtMAP65-1与微管之间的脱结合力。我们在体外聚合的微管溶液中加入AtMAP65-1使微管成束,用双光镊测定使微管之间的结合脱离的力。结果表明,使微管之间的结合脱离的力可能为7-5 pN或15 pN。 通过以上利用光镊技术对荧光标记微管力学性质的研究及微管结合蛋白AtMAP65-1与微管之间的脱结合力的研究,为研究微管动态和蛋白之间相互作用力提供了新的手段和思路,为更深入系统地研究细胞骨架分子力学特征及其他生物大分子的分子力学特征奠定了基础。


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