云南矮马与北京油鸡成纤维细胞系建立与鉴定的研究

【摘要】：我国幅员辽阔,地大物博,拥有丰富的家养动物资源。随着高产专门化品种的培育与推广,畜禽遗传资源多样性及其种质资源丧失程度日益加剧。为了进一步探索体细胞保存在物种遗传资源保存中的应用,本研究采取云南矮马和北京油鸡这两种具有地方特色的重要家养动物组织,通过细胞培养及染色体、同工酶分析,绿色荧光蛋白转染、PrP°基因序列测定与分析,对建立的细胞系生物学特性进行系统研究,以期为日后的体细胞克隆、结构基因组、功能基因约等研究提供详尽的数据和理论依据。 1.试验采用组织块直接培养法和胶原酶消化法,对云南矮马耳缘组织进行原代和继代培养,成功地建立了耳缘组织成纤维细胞系;细胞生长动态学观察表明,这两种培养方法培养的细胞的倍增时间分别为36.5h和31.5h,并且细胞经3次传代后形态无显著差异。通过实验结果分析,胶原酶消化培养法与组织块培养法两者的有机结合是进行矮马及其它动物耳缘等硬组织细胞培养的一种高效、快捷的方法,对于我国重要和濒危畜禽品种的遗传资源的细胞水平保存具有重要意义。另外,采用组织块直接培养法,对北京油鸡胚胎组织进行原代和继代培养,成功地建立了成纤维细胞系,该细胞系群体倍增时间为39.7h。试验对新建立的细胞系冷冻保存了一定数量的细胞,经冻存前和复苏后细胞活率检测,结果均在90%以上。 2.试验中对培养细胞进行形态学观察,核型和乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶两种酶的同工酶分析,以及重组绿色荧光蛋白在培养细胞中表达的观察,结果表明云南矮马耳缘组织成纤维细胞染色体众数2n=64的细胞数占92.9%;北京油鸡成纤维细胞染色体中二倍体占主体,为76%～88%;乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶同工酶电泳图谱与本室其它细胞系有明显差别;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性;云南矮马耳缘组织成纤维细胞和北京油鸡成纤维细胞转染绿色荧光蛋白的效率较高,分别达33%和25%。这两种细胞系的建立,使云南矮马和北京油鸡这两种国家重要遗传资源在细胞水平上得以保存下来,也为进一步基因组和体细胞克隆等研究提供了理想的生物材料。 3.试验采用PCR方法扩增了云南矮马和北京油鸡的PrP°基因,并进行序列测定,结合已发表种属朊蛋白基因序列,运用分子生物学软件进行同源性分析。结果表明,云南矮马PrP基因与牛的PrP基因同源性较远,因此感染牛源朊病毒的风险较小,禽类与哺乳动物PrP°氨基酸属于2个不同的进化分支,因此哺乳动物海绵状脑病不易传染给禽类或引起朊蛋白构型上的改变。这些结果可为海绵状脑病种间屏障补充详细的数据,对于该基因功能和生物进化研究具有重要意义。