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牛源大肠杆菌Ⅰ型整合子的调查及对氟苯尼考耐药性的研究

杜向党  
【摘要】:动物源病原菌对抗微生物耐药性的形成已经成为一个全球性关注的公共卫生问题,给畜牧业发展和人类健康带来严重的潜在威胁。因此,为了对细菌耐药性进行危害性分析和评估,本研究对我国北京周边地区分离的牛源致病性大肠杆菌进行了血清型鉴定和MICs值测定,利用PCR技术和直接测序对Ⅰ型整合子/基因盒的分子流行病学进行了调查与分析。 随后,采用PCR技术从三株耐氟苯尼考的牛源致病性大肠杆菌中克隆了floR基因,通过对floR基因上游调控序列的分析,构建耐氟苯尼考的基因工程菌株JM109-R。同时建立测定氟苯尼考在细菌内积聚的HPLC法,利用HPLC技术测定氟苯尼考在敏感和耐药大肠杆菌内的积聚,以确定大肠杆菌对氟苯尼考耐药性的分子机制。 临床分离的23株致病性大肠杆菌整合子/基因盒的调查与分析表明,Ⅰ型整合子的检出率达57%。对基因盒进行克隆和测序分析显示,北京周边地区牛源致病性大肠杆菌有6种基因盒流行,分别编码了对甲氧苄啶(dfrAl, dfrAl7),氨基糖苷类药物(aadB, aadAl和aadA5)和氯霉素(cmlA)的耐药性。其中,基因盒排列dfrAl-orf(45%)和aadB-orf-cmlA(32%)流行最为广泛,基因盒排列aadB-aadAl-cmlA为国内外首次报道。这些数据表明,Ⅰ型整合子/基因盒在北京周边地区流行比较普遍,同时为抗生素选择压力造成耐药性的广泛散播提供了重要的监视信息。 通过对23株致病性大肠杆菌的耐药谱以及Ⅰ型整合子/基因盒的调查分析还发现,菌株是否携带Ⅰ型整合子及耐药基因盒与其耐药谱有密切关系。耐药率较低的菌株几乎不携带Ⅰ型整合子,携带Ⅰ型整合子的菌株均耐受磺胺药,绝大部分还耐受甲氧苄啶,链霉素和/或壮观霉素以及氯霉素;而菌株对喹诺酮类、四环素类、青霉素类耐药表型与是否携带Ⅰ型整合子及耐药基因盒相关性不强。 本研究从耐氟苯尼考菌株中成功地克隆了floR基因,克隆的floR基因编码404个氨基酸的成熟多肽。与GenBank中已报道的动物源大肠杆菌floR基因核苷酸序列在开放阅读框的26、105、175、439、441、671、678、798、943、1070位分别存在着不同程度的点变异。 为了进一步阐明氟苯尼考的耐药机制,通过对floR基因上游调控序列的分析,本研究成功构建了pDux/floR质粒,随后转入到了基因工程菌JM109中,该菌株显示对氯霉素和氟苯尼考耐药。随后,本研究建立了测定氟苯尼考在细菌样本中积聚的HPLC法。该方法测定细菌样本中氟苯尼考的检测限为0.0125μg/ml,添加回收率在93.2%—101.4%之间,日内变异系数范围在2.1%—5.7%之间,日间变异系数范围在3.2%—5.6%之间。 HPLC技术测定氟苯尼考在敏感和耐药大肠杆菌内积聚的结果显示,耐氟苯尼考菌株比敏感菌株对氟苯尼考的积聚明显降低,达到稳态后,耐药大肠杆菌对氟苯尼考的积聚约低于敏感大肠杆菌的2倍。加入一种质子驱动力的阻断剂——氰氯苯腙,耐药菌株对氟苯尼考的积聚量迅速提高,进入稳态后,达到几乎与敏感菌株同样的积聚水平。这些结果国内外首次初步证实了floR基因编码的FloR蛋白通过主动泵出氟苯尼考而实现细菌耐药。


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