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《中国农业大学》 2005年
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猪脑心肌炎病毒VP1基因的原核表达、血清学调查及分离毒株的鉴定

盖新娜  
【摘要】:猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus, EMCV)引起猪的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。本研究成功地克隆并表达了EMCV结构蛋白VP1基因,利用表达的重组VP1蛋白建立了检测EMCV抗体的间接ELISA,并对我国部分地区猪场EMCV感染进行了血清学调查;从临床组织样本中分离到5株猪脑心肌炎病毒,对分离毒株的VP1基因和部分3D基因进行了序列分析。 采用RT-PCR技术扩增出猪EMCV的完整VP1基因,将目的片段克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,经0.1 mmol/L IPTG诱导后,重组蛋白GST-VP1的表达量可达27.1%,SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子量为60.0 kDa。Western-Blotting分析表明,重组蛋白可被EMCV阳性血清所识别。 以纯化的重组蛋白GST-VP1为抗原,建立了检测EMCV抗体的间接ELISA,并确定了间接ELISA的最佳工作条件。结果表明,重组蛋白抗原的最适包被浓度为0.625 μg/mL;待检血清的最适稀释度为1:50;HRP-兔抗猪lgG的最适工作浓度为1:800;待检血清和酶标二抗的反应条件为37℃ 45min;血清样本的阴阳性临界值为0.3。与间接免疫荧光试验比较,结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性。用建立的间接ELISA对我国13个地区规模化养猪场的1786份血清样本进行了检测,结果表明,EMCV抗体平均阳性率为75.84%。表明我国猪场已普遍存在EMCV感染。 利用BHK-21细胞,从北京、河北、天津、湖北和辽宁等地临床组织样本中分离到5株猪脑心肌炎病毒,分别命名为EMCVBJC3、EMCVHB1、EMCVHuB1、EMCVLN1和EMCVTJ1。对分离毒株进行了间接免疫荧光鉴定。免疫电镜观察结果表明,分离毒株的病毒粒子直径约27nm。理化特性鉴定结果表明,EMCV BJC3和HB1均不耐酸,对氯仿不敏感,但对胰蛋白酶有不同的敏感性,60℃加热1h可将病毒杀死,50℃热环境下Mg~(2+)对病毒几乎无保护作用。 对分离毒株的VP1基因和部分3D基因的序列测定和分析结果表明,5株EMCV VP1基因的核苷酸序列同源性在99%以上,其推导的氨基酸序列的同源性为97.5%以上;与GenBank中参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性介于81.61%~99.69%之间,氨基酸序列同源性为95.5%以上。分离毒株3D基因扩增片段的核苷酸序列和氨基酸序列与参考毒株的同源性均为100%。基于VP1基因的系统进化分析表明,5个分离毒株均位于系统进化树的主干上,其变异度不大。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S852.65

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