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《中国农业大学》 2005年
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鸡BF2和β2m分子特征与二级结构及其复合体鉴定病毒表位的研究

闫若潜  
【摘要】:鸡的主要组织相容性复合体Ⅰ(BF)位于16号染色体,分为主基因座(BF2)和次基因座(BF1)。BF2呈显性表达,可与抗原多肽和轻链(β2m)结合,将抗原多肽递呈给CTL细胞,诱导机体产生细胞性免疫应答。为了阐明我国地方优质品种鸡BF2和β2m的分子结构特征,解析BF2及β2m蛋白的空间结构、以及重建BF2-β2m复合体结合病毒抗原多肽系统,本研究采用PCR技术从三黄鸡、乌骨鸡和珍珠鸡群克隆了24个BF2基因和10个β2m基因。用pMAL-p2X/E.coli可溶性表达系分别表达了BF2和β2m与MBP融合蛋白。通过Amylose树脂亲合层析纯化、Factor Xa蛋白酶切、DEAE琼脂糖分子筛过柱,纯化了表达蛋白:MBP-BF2、MBP-β2m、MBP,采用圆二色谱(CD)测定了各类蛋白的二级结构(2D);并同源模建了BF2和β2m蛋白的三级结构(3D)。 随后,设计了一个富含甘氨酸和丝氨酸的接头[linker,(G_4S)_3],采用SOE-PCR技术将BF2-linker-β2m串联成基因链,再插入pMAL-p2X质粒进行可溶性融合表达并按上述方法分离纯化了融合MBP-BF2-linker-β2m和单体BF2-linker-β2m蛋白。圆二色谱(CD)测定了其2D。在此研究的基础上,采用了禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)T细胞表位多肽(AIV-HA5-TP1和AIV-HA9-TP2)与BF2-linker-β2m蛋白结合,用酸洗法从BF2-linker-β2m-peptide复合物中洗出AIV-HA5-TP1和AIV-HA9-TP2,再用C18柱去盐、去酸、换缓冲液,并冻干AIV-HA5-TP1和AIV-HA9-TP2,点样后用质谱仪测定其分子量和氨基酸序列图谱。 三品种鸡BF2氨基酸之间同源率为75.5%~99.2%,分别保留了人HLA-A2与抗原多肽结合的8个关键性氨基酸(YYYRTKWY)中的7、7、6个氨基酸。在抗原多肽结合区(PBD)氨基酸置换率高,与CD8~+、β2m接触的氨基酸大多保守。根据本研究自创氨基酸同源率91%为一类系谱的分类方法,将三品种鸡的24个BF2基因与所有来航鸡BF2基因分为11个系谱。其中,发现了三品种鸡中有5个等位基因群不同于来航鸡,为新的等位基因群。同时也发现了一类新的鸡β2m,与已报道的鸡β2m氨基酸的同源率为81.9%-84.0%。结果显示了三品种鸡BF2和β2m的分子特征。 CD结果表明,BF2蛋白呈典型的α螺旋结构,其2D结构元件α螺旋、β折叠、转角和随机蜷曲)的含量分别为72、102、70和90个氨基酸;β2m蛋白中分别为0、46、30和22个氨基酸;单体重组蛋白BF2-linker-β2m中分别为70、149、108和124个氨基酸。CD测定的BF2蛋白中α螺旋含量与EXPASY服务器(http://us.expasy.org/tools/)上预测的结果基本相符。鸡BF2、β2m蛋白以及重组BF2-linker-β2m蛋白二级结构元件含量与人HLA-A2和β2m的相似。同源模建的BF2和β2m 3D与人及小鼠的类似,但在α螺旋、β片层、β转角、无规则蜷曲的具体位置与数目方面存在差异。 质谱图谱表明,重建的BF2-linker-β2m在体外可成功结合AIV-HA5-TP1和AIV-HA9-TP2。这为进一步重建鸡MHC-β2m复合物体外鉴定病毒T细胞表位系统奠定了基础。 综上所述,本研究揭示了三品种鸡BF2和β2m基因的分子特征,获得了具有正常结构的BF2、β2m以及BF2-linker-β2m重组蛋白,阐明了其2D,并在体外初步重建了BF2-β2m复合体结合病毒抗原多肽系统。
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