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荧光假单胞菌2P24抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚生物合成的基因调控研究

周洪友  
【摘要】:抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG)产生菌的许多菌株是植物病害生物防治的热点。2,4-DAPG是一种广谱抗生素,可以防治多种土传病原菌引起的根部病害和苗期病害。大部分2,4-DAPG产生菌定殖能力强,具有很好的适应自然环境的能力。荧光假单胞菌Pseudomonaso fluorescens 2P24分离自小麦全蚀病自然衰退土壤,除产生2,4-DAPG外,还可以产生氢氰酸(HCN)、嗜铁素、蛋白酶等抑菌物质,是一株优良的生防菌株。本文首先对2,4-DAPG产生菌生防作用进行了初步研究,在此基础上探讨了菌株2P24抗生素2,4-DAPG生物合成及其调控基因。 本研究从植病生防室保存的假单胞菌中筛选得到2,4-DAPG产生菌,对沙打旺根腐病菌及番茄青枯病菌进行抑菌测定,从中筛选出拮抗性强,抑菌谱广,定殖能力好的优良菌株,并对沙打旺根腐病及番茄青枯病两种病害进行防病试验,进一步验证其生防作用。结果表明几株2,4-DAPG产生菌的防病能力都较强,尤其是Pseudomonas fluorescens 2P24和P.fluorescens CPF-10,生防效果在50%以上,并且具有较好的根部定殖能力。 利用已构建的菌株2P24基因组文库,克隆了抗生素2,4-DAPG合成基因簇,运用同源重组技术在2P24的2,4-DAPG合成基因 phlA中插入不带启动子的lacZ基因,构建了phlA-lacZ的转录融合子。利用Tn5转座子对该融合子的染色体随机突变,筛选出2,4-DAPG表达量降低的突变子2P24LacZ-A和2P24LacZ-H,互补可以部分恢复2,4-DAPG的表达量。 在抗生素2,4-DAPG合成基因簇的上游克隆得到两个完整的DNA开放阅读框架(ORF)PhlH和phlG,对phlH和phlG基因进行缺失突变,通过功能互补证明phlH可以正调控2,4-DAPG次生抗菌物质的产生;phlG基因的缺失突变体不能产生抗生素2,4-DAPG,但菌株仍具有一定的抑菌活性。通过 phlA::lacZ转录融合子,从转录水平进一步验证了phlH基因对抗生素2,4-DAPG正调控的关系。另外还通过该转录融合子,验证了GacS/GacA双因子调控系统对抗生素2,4-DAPG调控是转录后水平。 利用HPLC测定生防菌CPF-10和2P24在不同碳源、微量元素以及不同温度、培养时间对抗生素2,4-DAPG的产量的影响。结果表明不同碳源营养对两菌株抗生素2,4-DAPG的产量影响不同;菌株CPF-10以蔗糖为碳源时2,4-DAPG产量较高,而2P24的产量较低;以葡萄糖为碳源,2P24的2,4-DAPG的产量较高,而CPF-10基本上不产生,这与2菌株在蔗糖和葡萄糖培养基中对5种病原真菌平板抑菌试验结果相一致。温度对2,4-DAPG的产量也有一定的影响,2菌株在低温条件下(2P24在12℃和CPF-10在4℃)抗生素的产量最高;不同微量元素在不同营养条件下对2,4-DAPG的产量有一定影响,其中Zn~(2+)、Mo~(2+)等对2,4-DAPG产生影响较大。 利用Tn5转座子携带2,4-DAPG合成基因簇分别整合到野生荧光假单胞菌P32(2,4-DAPG)、CPF-10和2P24的染色体上,HPLC分析证明2,4-DAPG阴性菌P32可以产生抗生素2,4-DAPG,2,4-DAPG阳性菌CPF-10和2P24的抗生素产量可显著提高。对番茄青枯病菌、小麦全蚀病菌、棉花立枯病菌的平板抑菌试验和对番茄青枯病、小麦全蚀病温室防病试验,说明2,4-DAPG产量的提高,对防治病害具有增效作用。工程菌株与野生菌株在灭菌士中定殖能力没有显著差异,但在自然土中工程菌P32-38与野生菌P32的定殖能力具有显著差异。研究证明了提高抗生素2,4-DAPG的产量是提高荧光假单胞菌防治病害效果的有效途径之一。


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