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《中国农业大学》 2005年
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稗草C_4关键酶(PEPC、PPDK)基因的克隆及PEPC基因对水稻和烟草的遗传转化

张桂芳  
【摘要】:利用基因工程技术将C_4植物光合关键酶基因转入C_3植物以提高其光合、水分和氮素的利用效率已成为国内外研究的一个重要方向。稗属(Echinochloa)植物是稻田中典型的C_4型杂草,具有适应性广、抗逆性强和生长势强等特点,至今对稗属植物有关C_4关键酶的研究与利用仍属空白。本研究以稗草(Echinochloa crusgalli)和家稗(Echinochloa frumentacea)为材料克隆C_4关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因,并对水、旱稻和双子叶植物烟草进行了遗传转化,取得了以下结果: 首次从稗草和家稗中成功克隆了完整的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(Ppc cDNA)(基因登录号为:AY251482,)和丙酮酸磷酸双激酶基因(Pdk cDNA)(基因登录号为:AY792619),分别被命名为EcPpc和EfPdk。其核苷酸序列总长度分别为2886bp和2838bp,编码蛋白酶的氨基酸残基数分别为961和945。同源与序列对比分析表明这两个基因分别为根型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和C_4型丙酮酸磷酸双激酶基因。 将稗草PpC基因分别与强组成性表达的启动子Ubiquitin基因的启动子(pUbi)、在叶组织中受强光调控的特异性表达的特异性启动子1,5二磷酸核酮糖羧化酶基因(Rubisco)小亚基基因启动子(pRbcS)和玉米PEPC基因启动子(pZmp)融合分别构建了3个植物表达载体pUbi-EppC、pRbcS-EppC、pZmp-EppC。 利用己构建的载体以及含有玉米完整的C_4型PEPC核基因的表达载体pCB-ZMppc,通过农杆菌介导法对水稻和烟草进行了遗传转化,共获得转化水/旱稻120株和烟草34株。 PCR扩增检测结果证明,多数植株都能扩增出目的基因Ppc和标记基因潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的预知目的片段,而对照植株都没有扩增产物。RT-PCR和Western杂交检测也得到了相应证据。表明稗草Ppc基因已经整合到转基因水稻的基因组中并分别在mRNA和蛋白质水平得到了表达。 对转PEPC基因水稻进行酶活和光合性能的测定表明,转入稗草Ppc基因cDNA的水稻植株,绝大多数PEPC活性明显高于对照,最大为对照的8.07倍;转入玉米PEPC基因的水稻的PEPC活性最大高于对照10倍。初步表明转入完整的基因组DNA表达效果更好。PEPC活性比较结果表明,转入旱稻后PEPC的活性的增加幅度明显高于转入水稻的植株,本研究所获得的PEPC活性最高的植株均为旱稻,初步证明向旱稻内转入Ppc基因,更易得到较高的表达效率。光合性能测定结果表明,转Ppc基因植株光合性能得到了综合改善。净光合速率与气孔导度、蒸腾速率表现正相关(相关系数分别为r~2=0.5718、r~2=0.4267)。表明外源Ppc基因同时调节了水稻的羧化能力与气孔运动。而且过表达PEPC的水稻具有更高的水分利用效率。 将稗草PEPC基因cDNA完整片段和玉米C_4特异的Ppc基因转入了双子叶植物烟草,结果表明稗草PEPC基因的cDNA完整片段能够在烟草中正确表达。而转入玉米C_4特异的完整Ppc基因的烟草叶绿体破坏严重,分化生长能力较差。可能是由于不正确的转录起始、终止,以及发生错误的拼接,造成玉米C_4特异的完整PpC基因不能在烟草中很好的表达。证明种系发生的距离可能会妨碍C_4植物基因在C_3植物中的正常表达。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S188

【引证文献】
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