甘草酸ELISA法建立及栽培甘草产量与品质调控机理研究
【摘要】：本项研究针对目前我国中药材野生甘草家植栽培生产中产量与品质形成不协调的问题及缺少有效成分甘草酸快速检测方法的实际问题,应用生物免疫技术,开展了甘草酸ELISA检测方法的研究以及在大田和PVC管栽培条件下,应用植物生长物质HKL-4,从整株水平上研究了甘草地上与地下器官的物质代谢及其生理活性与产量品质高效表达的内在关系,进一步探讨生物化学调控技术在促进甘草栽培产量与品质高效协同表达的潜力和作用机制。主要研究内容及结果如下:
1.首次采用碳化二亚胺法用甘草酸偶联BSA,制备免疫抗原,并免疫小白鼠,获得了高效价(3.2×10~6)的抗甘草酸多克隆抗体,并在我国首次建立了甘草酸ELISA法,检测范围为3～283ng/mL。用所建立的甘草酸ELISA法应用于甘草样品实测,并以HPLC法加以验证,结果表明,所建立的ELISA分析方法测定的数据与HPLC分析方法有很好的相关性(R~2=0.9918)。
2.利用甘草酸ELISA法,首次揭示了甘草酸含量在2年生甘草主要生育期内的变化趋势,结果表明在晚秋时甘草产量与甘草酸含量是协调期;从纵向根段分析显示,甘草酸含量在距根头50cm以下分布最多;根状茎中靠近主根处甘草酸含量高。
3.HKL-4处理调控了内源激素信息系统,提高了根内源IAA、GA_4和CTKs的含量,改善了根系的生理活性,调控了物质向根的运输强度,促进了甘草根及根状茎产量与品质的协同表达,如根粗及根状茎芽数有明显的增加,使产量提高13.8%,根中甘草酸含量提高32.4%,HKL-4处理后主要提高了采收部位(根头到60cm处)的甘草酸含量;黄酮类含量提高35.3～47.5%。
4.HKL-4处理后,叶绿体、淀粉粒和线粒体等体积增大,数量增多,基粒片层垛叠增多;叶片的叶绿素含量、光合效率较对照均显著提高,提高了叶片内源IAA、GA_4和CTKs的含量,降低了ABA含量。这些内源激素的含量变化,提高了叶片的生理活性,促进了叶片的生长和延缓了叶片的衰老,体现在HKL-4处理叶片后,SOD、CAT活性得到了显著的提高,降低MDA含量和POD活性。
5.首次通过LC/ESI-MS提取离子流指纹图谱分析,对应用HKL-4喷施后甘草根中化学成分安全性评价。结果表明,HKL-4处理后甘草中化学成分没有发现新增的化合物,HKL-4在甘草上应用是安全的,同时确定的7种特征成分的含量得到了正向调控,改善了品质。
【关键词】：甘草 甘草酸 酶联免疫吸附分析 产量品质 生物化学控制技术 栽培 【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：S567.71
【目录】：
- 第一章 前言9-23
- 1 甘草在中药中的地位9
- 2 甘草种质资源9-11
- 2.1 甘草属植物分类9
- 2.2 甘草属植物在我国的分布9-11
- 3 甘草的化学成分11
- 4 甘草有效成分分析检测11-17
- 4.1 高效液相色谱法11
- 4.2 高效毛细管电泳法11-12
- 4.3 薄层扫描法12
- 4.4 药材有效成分免疫分析技术12-17
- 5 甘草栽培研究17-21
- 5.1 甘草栽培研究现状17-18
- 5.2 栽培甘草产量和品质的协同表达18-21
- 6 本研究的意义及设计思路21-23
- 6.1 研究的意义21-22
- 6.2 研究设计思路22-23
- 第二章 甘草酸酶联免疫吸附分析检测(ELISA)方法的建立23-41
- 1 材料与方法23-25
- 1.1 材料和试剂23-24
- 1.2 ELISA测定所用缓冲液24
- 1.3 主要仪器设备24-25
- 2 实验方法25-31
- 2.1 免疫原和包被抗原的合成25-26
- 2.2 抗原与载体蛋白的偶联比率估算26
- 2.3 多克隆抗体的制备26-28
- 2.4 间接竞争ELISA工作条件的筛选28-29
- 2.5 抗体标准曲线建立29
- 2.6 抗体特异性考察29-30
- 2.7 甘草酸ELISA方法的应用及方法确证30-31
- 3 结果与分析31-37
- 3.1 半抗原与载体蛋白的偶联结果31-32
- 3.2 抗血清的效价32-34
- 3.4 标准抑制曲线的建立34-35
- 3.5 多克隆抗体的特异性考察35-36
- 3.6 甘草酸添加回收测定36-37
- 3.7 ELISA方法测定样品的验证37
- 4 讨论37-41
- 4.1 免疫抗原的制备37-38
- 4.2 多克隆抗体的制备38-39
- 4.3 ELISA方法的建立39-40
- 4.4 甘草酸ELISA法与HPLC法的比较40-41
- 第三章 HKL-4对栽培甘草的产量与品质的协同表达调控41-54
- 1 材料与方法41-43
- 1.1 试验设计41
- 1.2 取样及测定方法41-43
- 2 结果与分析43-53
- 2.1 栽培甘草发育的生物学特点43
- 2.2 HKL一4对甘草根产量构成因子的影响43-44
- 2.3 产量因子间相关性的分析44-46
- 2.4 甘草药材品质形成及调控效应46-53
- 3 小结53-54
- 第四章 HKL-4对甘草化学成分安全性的指纹图谱评价研究54-73
- 1 材料与方法54-55
- 1.1 样品来源54
- 1.2 样品制备54
- 1.3 试剂与仪器54
- 1.4 色谱条件54-55
- 1.5 质谱条件55
- 2 结果与分析55-72
- 2.1 甘草根紫外指纹图谱分析55-56
- 2.2 甘草根液相色谱／离子阱质谱联用指纹图谱分析56-72
- 3 小结72-73
- 第五章 甘草产量与品质形成过程中根叶生理活性表达的调控73-86
- 1 材料与方法73-76
- 1.1 叶片超薄切片的制作和观察73
- 1.2 叶绿素相对含量(SPAD值)测定73
- 1.3 叶绿素PSⅡ化学效率测定73
- 1.4 活性氧代谢酶活性测定73-74
- 1.5.可溶性蛋白质测定74
- 1.6 过氧化物酶同工酶测定74-75
- 1.7 苯丙氨酸解氨酶(PAL)的测定75
- 1.8 苯丙氨酸的测定75-76
- 2 结果与分析76-84
- 2.1 HKL-4对甘草叶片超微结构的影响76-77
- 2.2 HKL-4对叶片叶绿素含量的影响77
- 2.3 HKL-4对甘草叶片PSⅡ光化学效率的影响77-78
- 2.4 HKL-4对甘草中MDA含量的影响78-79
- 2.5 HKL-4对甘草细胞保护酶的影响79-82
- 2.6 HKL-4对甘草叶片可溶性蛋白含量的影响82-83
- 2.7 HKL-4对甘草根中可溶性蛋白含量的影响83
- 2.8 HKL-4对甘草根中苯丙氨酸含量的影响83-84
- 2.9 HKL-4对根中苯丙氨酸解氨酶活性的影响84
- 3 小结84-86
- 第六章 HKL-4对栽培甘草内源激素信息系统调控86-97
- 1 材料与方法86
- 1.1 试验设计86
- 1.2 激素测定方法86
- 2 结果与分析86-95
- 2.1 HKL-4处理对甘草功能叶内源激素含量的调控86-88
- 2.2 HKL-4处理对甘草茎内源激素含量的调控88-90
- 2.3 HKL-4处理对甘草根状茎内源激素含量的调控90-92
- 2.4 HKL-4处理对甘草根内源激素含量的调控92-95
- 3 小结95-97
- 第七章 讨论97-105
- 参考文献105-116
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