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《中国农业大学》 2005年
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嗜烟碱节杆菌烟碱脱氢酶性质及其在烟草加工中的应用研究

马林  
【摘要】:烟碱(尼古丁)占烟草生物碱总量的95%以上。长期吸烟会导致对烟碱的依赖性,而过量吸入烟碱则会抑制中枢神经,麻痹心脏,甚至有致命的危险;许多国家政府立法强制规定香烟盒上必须标明烟碱含量以及警告消费者吸烟有害健康的宣传语。因此,在工业上利用微生物及其酶来降解烟草烟碱,不仅对于维护人类健康有着深远的意义,而且可以改进烟气品质,提高烟叶资源的利用率,有重大的经济效益。 (1)降解烟碱菌株的筛选及鉴定:通过使用含烟碱的限制性培养基的方法,从土壤中筛选出一株具有高效降解烟碱能力的菌株Z3,根据该菌株的培养特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析,将其命名为嗜烟碱节杆菌Z3(Arthrobacter nicotinovorans Z3),与嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)有98.7%的同源性。 (2)嗜烟碱节杆菌Z3产烟碱脱氢酶条件优化:在摇瓶条件下,研究不同碳源和氮源对节杆菌Z3产酶的影响,以便优化培养基。实验结果表明,烟碱是最佳碳源,酵母提取物和(NH_4)_2SO_4为最佳氮源。其发酵产酶条件为:摇床转速220r/min,接种量5%,初始pH 7.0,温度30℃,发酵时间48h。 (3)烟碱脱氢酶的纯化及酶学性质研究:嗜烟碱节杆菌Z3粗酶液经硫酸铵分级沉淀、离子交换柱层析和凝胶过滤层析等步骤分离纯化,得到电泳纯的烟碱脱氢酶。整个纯化过程其酶活回收率为6.57%,纯化倍数为44.67倍,酶分子量约为126 kDa。酶反应最适pH为7.0,最适温度为40℃。该酶在50℃保温5h后酶活力仍有60%以上。Mn~(2+)、Co~(2+)能提高酶活力,分别是对照酶活力的153%和127%。Cu~(2+)对酶活力有抑制作用。酶对烟碱的K_m=7.694×10~(-4)mol/L,V_(max)=9.95×10~(-4)mol/(min·mg)。 (4)降解烟碱工程菌的构建:使用表达质粒载体pET-17B和表达菌株BL21(DE3)pLYS,构建降解烟碱工程菌并实现活性表达。在相同发酵时间内工程菌产酶能力为Z3菌的25倍。并对重组烟碱脱氢酶进行纯化,重组烟碱脱氢酶由A、B和C三个亚基组成,其蛋白分子量分别为87 kDa、30 kDa和15 kDa。 (5)烟碱脱氢酶降解烟碱的条件及其降解产物的安全性评价:通过高效液相色谱法测定烟碱含量变化,烟碱降解反应体系在NAD、亚甲基蓝和2,6-二氯苯靛酚的参与下,烟碱脱氢酶催化烟碱发生了明显的降解反应,烟碱分别降解了48.92%、16.53%和15.68%。不加电子传递体烟碱不变化,或仅有少量降解。通过动物实验和Ames实验证明烟碱降解产物的毒性小于烟碱。 (6)烟碱脱氢酶在烟草工业中的应用:探讨了烟碱脱氢酶在造纸法烟草薄片和白肋烟处理中的应用方式。结果表明,在烟草薄片提取液中加入2%的烟碱脱氢酶酶液(v/w,酶浓度1.0 mg/ml)及过量的NAD,40℃下反应16h后,烟碱降解率为50.58%。在加酶量10mg/kg和过量的NAD及酶解12h的条件下,白肋烟烟叶的烟碱含量从5.82%降至2.85%。经过烟碱脱氢酶处理的烟草薄片和白肋烟的烟气品质均得到提高。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:TS41

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