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鲢鱼骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化、性质鉴定及对肿瘤细胞增殖的影响

胡新颖  
【摘要】:催化蛋白质水解反应的蛋白酶活性受几种机制的控制,包括天然蛋白酶抑制剂的抑制作用。大多数蛋白酶抑制剂通过对蛋白酶活性的可逆抑制作用调控细胞生理过程,因此蛋白酶抑制剂具有广泛的用途。鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)在我国资源丰富,对鲢鱼的开发和利用尚在初级加工的水平,有必要提高鲢鱼产品的附加值。在鲢鱼鱼糜制品的生产中,蛋白酶抑制剂的使用可防止由于蛋白酶的降解作用导致的鱼糜软化,但是添加这些含蛋白酶抑制剂物质会给最终产品带来不好的风味和色泽,因此需要研制其它替代抑制剂来改善最终产品的品质。由于影响鱼糜质量的主要是内源性的丝氨酸蛋白酶,因此本论文以内源性的丝氨酸蛋白酶抑制剂作为研究目标;对鲢鱼肌肉中的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行了分离纯化,对其进行了基本性质的测定,研究了丝氨酸蛋白酶抑制剂对肌原纤维自溶的影响,并探讨了其对肿瘤细胞生长及细胞周期的影响,为淡水鱼的高效加工利用提供理论依据。 鲢鱼骨骼肌经过前处理后用2%KCl粗提,经过DEAE-Sephacel阴离子交换层析、SP-Sepharose EE阳离子交换层析、Blue-Sepharose 6 F.F.染料亲和层析和Con-Sepharose外源凝集素亲和层析得到丝氨酸蛋白酶抑制剂,纯化倍数约为266倍,抑制剂总活性回收率为6%左右。该抑制剂分子量约为50kD。当温度60℃时,抑制剂热稳定性开始大幅度降低,70℃时的活性仅为初始活性的30%左右。该抑制剂有较宽的pH稳定性(pH3-11)。K~+对抑制剂的活性有促进作用,而Mg~(2+)、Na+和C~(2+)对抑制剂没有激活效果,因此K~+可能是它的潜在激活剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂对丝氨酸蛋白酶家族中的牛胰凝乳蛋白酶、牛胰蛋白酶、猪胰蛋白酶三种蛋白酶的活性均有强烈的抑制作用;而对半胱氨酸蛋白酶家族中的木瓜蛋白酶及天冬氨酸蛋白酶家族中的牛胃蛋白酶几乎没有作用。抑制剂的抑制活性在一定范围内呈剂量依赖型。电泳分析证实抑制剂与酶的作用方式是与酶结合形成高分子复合物。用肽质量指纹技术对丝氨酸蛋白酶抑制剂的内部氨基酸顺序进行分析时,没有发现与已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂有同源性。用EDMAN降解法对丝氨酸蛋白酶抑制剂N端的10个氨基酸顺序进行测定,推测末端序列是:ARYEDHDCDG,也没有发现与已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂有同源性。 鲢鱼肌原纤维蛋白在55℃条件下有着显著的自溶作用。提纯的丝氨酸蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和金属蛋白酶抑制剂EDTA都能抑制肌球蛋白重链(MHC)的分解。实验证实引起肌球蛋白重链分解的酶可能是多种内源性蛋白酶,也可能是一种骨骼肌结合酶。通过添加提纯的鲢鱼丝氨酸蛋白酶抑制剂则可显著地抑制由外源胰蛋白酶引起的鲢鱼肌原纤维蛋白的水解反应。 丝氨酸蛋白酶抑制剂对三种肿瘤细胞Sp20、Jarkat、MG63的增殖都有抑制作用。这种抑制作用呈剂量依赖型,其中对Jarkat细胞在0.1g/L的浓度下就可以达到明显的抑制作用。Jarkat细胞在抑制剂处理8h后,细胞周期阻滞在G_0/G_1期。抑制剂处理Jarkat细胞24h后没有观察到明显的凋亡现象。


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