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番茄中病毒诱导基因沉默体系的建立及LeEIN2基因功能分析

傅达奇  
【摘要】:近年来,植物基因组测序为我们提供了大量的序列信息,我们有必要建立大规模基因功能分析方法。反义技术常被用来抑制植物目的基因表达,但该方法需要稳定的遗传转化操作。许多物种的遗传转化比较困难,一些基因的功能缺失还将导致植物死亡。病毒诱导的基因沉默不需要遗传转化操作,可以作为敲除目的基因的一种替代方法。 番茄是研究果实成熟机理的模式材料。尽管在番茄幼苗中已经成功建立了病毒诱导的基因沉默体系,但番茄的花和果实中未见有相关报道。研究发现,最适生长条件下(22℃-28℃,60-70%RH)生长的番茄幼苗目的基因沉默效果不能在花和果实中观察到。但当番茄幼苗在相对较低的温度和湿度条件下(15℃-18℃,30-40%RH)生长时,烟草脆裂病毒能有效的转移到花和果实等器官。研究发现番茄幼苗产生的PDS基因沉默效果能通过茎传递到花和果实等器官,并维持番茄植株的整个生长发育时期。PDS基因沉默导致了叶片,花和果实组织中PDS基因mRNA水平的显著降低和前体物质八氢番茄红素的明显上升。另外,与对照相比,PDS沉默叶片的叶绿素a,叶绿素b和总叶绿素含量被降低了90%以上,红熟期和破色期沉默番茄果实番茄红素含量降低了98%。实验结果显示该方法便于对番茄果实发育和成熟过程中的相关基因进行大规模功能分析,是植物遗传转化的替代方法。 通过离体番茄果实的真空渗透,活体果实的果实表面,果柄和果茎注射等方式侵染番茄果实,烟草脆裂病毒在番茄果实中能有效的复制和转移。尽管上述四种方法均能对番茄果实形成有效侵染,但花后10天的番茄果实果柄注射是在番茄果实中建立病毒诱导基因沉默的最有效方法。对于离体果实的真空渗透,我们发现LeACS2基因沉默番茄果实的ACC和乙烯生成量与对照果实相比显著降低,大约有65%的番茄果实在真空渗透后腐烂。对于果柄注射侵染实验,我们选择乙烯信号传导途径中的LeCIRl和LeEILs两个基因为报告基因,LeCTRl基因沉默促进了番茄果实成熟,而LeEILs沉默则抑制了番茄果实成熟。这些结果进一步说明了LeCTRl和LeEILs是番茄果实成熟所必须。 LeEIN2基因沉默抑制了番茄果实的成熟。随着果实的生长发育,我们发现由于LeEIN2基因被抑制,LeEIN2基因沉默番茄果实沉默部位保持绿色,不能成熟,同一果实的其它部位变成红色,对照番茄果实变红并软化。另外,LeEIN2基因沉默番茄果实的绿色组织中E4基因(成熟相关基因)表达量低,与未熟期对照果实的表达模式一致,而沉默果实的红色组织具有较高的E4基因表达水平。这些结果显示LeEIN2基因在番茄果实成熟过程中扮演着重要角色。 我们第一次在番茄花和果实中建立了病毒诱导的基因沉默体系,该方法将有利于对番茄果实发育和成熟相关基因进行大规模功能分析。在番茄果实中建立的病毒诱导基因沉默体系也将便于直接在番茄果实中进行成熟相关基因的大规模和高通量分析。


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