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《中国农业大学》 2005年
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小麦杂交种与亲本之间差异表达基因的分离、克隆与功能鉴定

姚颖垠  
【摘要】:研究表明,杂种优势的形成与杂种一代中亲本基因的表达方式改变有关。为深入探讨基因差异表达与小麦杂种优势表现的关系,本研究以普通小麦(Triticum aestivum L)3338和斯卑尔脱小麦(Trticum spelta L)2463及其种间杂交种3338/2463为材料,采用抑制差减杂交技术,对杂种与亲本叶片和根系中差异表达的EST进行了批量克隆,并对部分EST进行了差异表达验证、电子定位和比较基因组学分析。另外,还分离了部分差异表达基因的完整ORF序列,完成了其表达模式分析,并将其中的3个基因(14-3-3、ADP核糖基化因子以及组蛋白脱乙酰化酶基因)转化拟南芥,得到了表型存在明显变异的阳性植株。主要结果如下: 1.采用温室营养液培养方法,系统测定了种间杂交种3338/2463与其亲本根系性状的表现,并计算了各性状的中亲优势和超亲优势。结果表明,5个性状(总根长、根表面积、总体积、根尖数、根干重)的中亲优势均超过20%,而且达到显著水平,尤其是根干重,中亲优势和超亲优势分别达到35.32%和25.52%,而叶干重的中亲优势为23.33%,超亲优势未达到显著水平,可见根系的杂种优势幅度要大于地上部。同时提出以“遗传发育相对简单的根系”作为模式性状开展研究,将有助于加深对小麦杂种优势分子机理的认识。 2.利用抑制差减杂交法,构建了4个小麦杂交种与亲本的差减EST文库,分别富集了根系中杂种增强、杂种减弱表达以及叶片中杂种增强、杂种减弱表达的基因,并依次命名为根系杂种库、根系亲本库、叶片杂种库、叶片亲本库。对4个库中926个EST进行了测序,获得了748个非冗余的EST序列。这是目前对小麦杂交种和亲本之间最大规模的差异表达EST的分离和克隆结果。BLASTX分析结果表明,有465个EST推测编码的蛋白质与其他物种的己知蛋白氨基酸具有很高的相似性,其功能涉及到植物生长发育的各个过程,包括新陈代谢、细胞生长与维持、光合作用、转录调控、抗逆性等。 3.采用反向Northern技术验证了443个来自于根系差减杂交库的EST的差异表达,发现68.16%的基因在杂交种与亲本之间的差异表达模式与SSH结果相一致:对18个基因进行了半定量RT-PCR分析,结果显示其中的15个与SSH结果一致;另外,采用荧光实时定量PCR技术分析了3个EST的表达情况,发现其差异表达模式与SSH、半定量RT-PCR以及反向Northern结果一致。 4.利用比较基因组学的方法将差异表达EST定位在水稻的基因组上,并与前人定位的水稻杂种优势位点进行了比较分析。结果发现,有104个EST定位于4个控制水稻产量性状杂种优势QTL位点中(90%,E值e~(-10))。其中有30个EST位于控制每穗粒数的杂种优势区域,9个EST位于控制每株分蘖数的区域,34个EST位于控制千粒重的区域,另外52个EST位于控制产量的杂种优势位点。这是目前对小麦杂交种与亲本之间差异表达EST最大规模的定位和比较基因组定位结果,为实现杂种优势的分子基础和遗传基础的整合提供了可能的研究途径和方法。 5.采用电子克隆结合RT-PCR的方法验证,分离克隆了25个具有完整ORF结构的差异表达基因,其中包括15个小麦核糖体蛋白基因(TaRP),GTP结合蛋白(TaRab),20S蛋白酶体β
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S512.1

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