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《中国农业大学》 2005年
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拟南芥1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶在光形态建成中的功能研究

秦治翔  
【摘要】:1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶(简称5/6-激酶)是磷酸肌醇代谢过程中的一种重要的调控酶。动物细胞中,它具有肌醇激酶和蛋白激酶双重活性,还能进行自身磷酸化,是一个从植物到人甚至线虫都保守的酶;而且5/6-激酶还是第一个鉴定出的与COP9信号体(简称CSN)互作的蛋白激酶,但它们互作的生物学意义还不清楚。植物细胞中,仅知道5/6-激酶是一种广泛存在的肌醇激酶,有关它的功能没有更多的报道。因此,研究5/6-激酶是否具有蛋白激酶的活性、是否与CSN互作,并参与植物的光形态建成,对揭示5/6-激酶的生物学功能,阐明植物光形态建成机理等方面具有重要的理论意义。 本文以拟南芥为材料,克隆了5/6-激酶的基因(命名为AtItpk-1),并进行了原核表达(His标签),纯化融合蛋白并制备了多克隆抗体。通过对AtItpk-1在不同光质下的表达分析,发现它受红光强诱导,说明AtItpk-1可能参与了植物对红光的应答。通过对AtItpk-1在拟南芥中的定位研究,发现AtItpk-1定位在细胞核中。 为了研究5/6-激酶在拟南芥中的生物学意义,对AtItpk-1的T-DNA插入突变体atitpk-1-1和atitpk-1-2进行了筛选和鉴定,并通过转基因技术获得了超表达AtItpk-1基因的转基因植株。表型分析表明,与野生型相比,atitpk-1突变体表现为红光抑制下胚轴伸长,超表达植株则表现为红光促进下胚轴伸长。另外,当将AtItpk-1基因转到突变体atitpk-1-1中,下胚轴伸长便恢复到与野生型一样。这些结果表明拟南芥5/6-激酶AtItpk-1可能参与了红光下的光形态建成。 利用我们制备的有活性的GST-AtItpk-1融合蛋白,进行了自身磷酸化实验,发现AtItpk-1具有蛋白激酶的活性。这为进一步解释5/6-激酶在光形态建成中的可能作用提供了线索。 以fus6/CSN1-3-4为材料,利用AtItpk-1的抗体和CSN4、CSN5的抗体,进行了5/6-激酶和CSN的免疫共沉淀实验,结果发现拟南芥的5/6-激酶可以和CSN共沉淀。基于免疫共沉淀和AtItpk-1、CSN都是核蛋白的结果,我们认为在拟南芥中存在5/6-激酶和CSN互作的可能性。 本研究发现了拟南芥的5/6-激酶参与了红光下的光形态建成,这一作用可能是通过与CSN互作完成的,并且5/6-激酶在光形态建成中的功能可能是通过它的蛋白激酶活性来实现的。但是,植物的光形态建成是一个非常复杂的过程,5/6-激酶参与光形态建成的具体机制仍需要进一步探讨。
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