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水稻Ca~(2+)/H~+反向转运体OsCAX3的功能、表达特性及调控序列研究

祁碧菽  
【摘要】:Ca~(2+)在植物中具有非常重要的作用,它既是植物必需的营养元素,又是植物响应体内发育信息和外部刺激的重要信使。为了保持体内的Ca~(2+)平衡,植物必须通过Ca~(2+)转运系统来完成对Ca~(2+)的运输。Ca~(2+)/H~+反向转运体作为一类Ca~(2+)外向转运器,在植物的营养和信号转导中起着非常重要的作用:使胞内Ca~(2+)浓度处于静息水平,终止Ca~(2+)信号;将Ca~(2+)储存进内质网、液泡等细胞器,作为信号转导中的Ca~(2+)源来调控Ca~(2+)的释放;将Ca~(2+)正确分配到各细胞器中,从而确保各种特异生化反应的顺利进行。水稻既是一种重要的粮食作物,又是生物学研究的模式植物,因此,对于水稻Ca~(2+)/H~+反向转运体具有理论和实践的双重意义。 本文对水稻的Ca~(2+)/H~+反向转运体OsCAX3进行了研究。我们首先克隆了该基因,序列分析发现OsCAX3具有11个的跨膜区,是一个膜蛋白,它与其它Ca~(2+)/H~+反向转运体有很高的同源性。 用RT-PCR的方法研究了OsCAX3在水稻中的表达特性,OsCAX3在水稻幼苗的根和叶中都有表达,表达量差别不大。OsCAX3在RNA水平上受到外源Ca~(2+)的强烈诱导,K~+、Na~+、Mg~(2+)和4℃处理后,可轻微诱导OsCAX3表达,而Mn~(2+)和PEG的处理则使OsCAX3的表达轻微降低。 利用PSORT Prediction进行亚细胞定位预测分析发现OsCAX3定位于植物细胞质膜,为了验证这一结果,我们构建了OsCAX3-GFP瞬时表达载体和稳定表达载体,分别转化拟南芥叶肉细胞原生质体和烟草,结果显示OsCAX3-GFP定位在拟南芥原生质体细胞膜和转基因烟草表皮细胞膜以及表皮毛细胞膜上。 转化酵母突变体K667显示OsCAX3具有转运Ca~(2+)的功能,但不能转运Mn~(2+)、Cu~(2+)、Ni~(2+)、Na~+、Zn~(2+)。我们利用转基因烟草研究了OsCAX3在植物中的功能。OsCAX3过表达转基因烟草与野生型烟草在pH5.7的1/2MS培养基上和加入100mM CaCl_2、pH5.7的1/2MS培养基上生长没有差别,植株中的Ca~(2+)含量也差别不大。但在含100mM CaCl_2、pH7.2的1/2MS培养基上,转基因烟草的生长好于野生型,而且植株的Ca~(2+)含量少于野生型植株中的Ca~(2+)含量。 在对OsCAX3转运Ca~(2+)功能的调控研究中发现,OsCAX3的N端1-26个氨基酸参与了OsCAX3转运Ca~(2+)功能的调控。


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