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《中国农业大学》 2005年
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特异性二价核酶基因构建与抗PLRV转基因马铃薯的研究

张剑峰  
【摘要】:根据锤头状核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)中国分离株(PLRV-Ch)复制酶基因负链RNA的二价核酶序列。将该核酶基因克隆到pGEM-4Z中,构建成体外转录载体pGEM-4ZDR;同时将包含核酶切割识别位点的PLRV-Ch复制酶基因cDNA近5’端的874bp片段反向插入到pGEM-4Z中,构建了体外转录载体pGEM-4ZR5。以线性化的重组质粒pGEM-4ZDR和pGEM-4ZR5为模板,在T7 RNA聚合酶的作用下,分别转录获得核酶RNA和PLRV-Ch复制酶基因5’端负链RNA底物片段。将以上两种RNA转录物混合并经37℃保溫后,检测结果表明所得核酶RNA对PLRV-Ch复制酶基因负链RNA在体外具有较强地特异切割活性。 为了进一步培育抗卷叶病毒的转基因马铃薯,将所克隆的核酶基因导入双元质粒pROKⅡ中,获得植物表达载体pROKⅡ/DR,经三亲融合转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404(pAL4404),用于介导叶盘法转化马铃薯外植体。经PCR和Southern-blot检测,证明目的基因被成功地导入所得马铃薯再生植株,其转化率约为14.5%,并能够在无性繁殖后代植株中稳定存在。RNA dot-blot和RT-PCR检测表明,再生马铃薯植株中的二价核酶基因可以转录表达。蚜虫传毒接种PLRV后的抗病性鉴定结果表明,所得到的转基因马铃薯株系分别表现出不同程度的抗病性。其中,经病毒接种的转基因马铃薯株系L5、L7、L8和J-1的无性繁殖后代在续发感染中仍表现出较高的抗病性,产量损失与感病受体品种对照相比明显降低。在防虫、无病小区中进行的产量鉴定试验表明,转核酶基因马铃薯株系间的产量变异幅度较大。其中对PLRV表现高抗的转基因株系L5和J-1产量与未转基因受体品种差异不大,为最终获得抗PLRV马铃薯新品系奠定了基础。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S532

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 岳红;卢其能;赵昶灵;;马铃薯卷叶病毒基因组的结构与功能综述[J];江苏农业科学;2012年04期
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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6 张鹤龄;;我国马铃薯品质改良,抗真菌细菌病害基因工程进展[A];中国马铃薯学术研讨会与第五届世界马铃薯大会论文集[C];2004年
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8 吴洁;周宇;张雪梅;阎文昭;;幽门螺杆菌热休克蛋白基因HspB-C对甘薯遗传转化的研究[A];中国核科学技术进展报告——中国核学会2009年学术年会论文集(第一卷·第8册)[C];2009年
9 赵悦平;张志华;;核桃组织培养研究进展[A];第三届全国干果生产与科研进展学术研讨会论文集[C];2003年
10 樊继德;孔庆国;张梅;于喜艳;;子房注射法获得转基因甜瓜植株[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐丽;马铃薯Y病毒复制酶基因介导的病毒抗性研究[D];山东农业大学;2010年
2 董玉梅;马铃薯L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因的克隆和功能分析[D];山东农业大学;2011年
3 冯守千;红梨着色机理的研究[D];山东农业大学;2011年
4 马进;水稻条纹病毒(RSV)RNA3、RNA4的克隆与抗RSV转基因水稻的培育[D];山东农业大学;2011年
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6 郝金凤;无载体无选择标记转基因耐贮藏甜瓜的培育[D];内蒙古大学;2010年
7 杜振国;三种水稻病毒基因沉默抑制子的鉴定和研究[D];福建农林大学;2011年
8 王钱洁;AP2/ERF转录因子与水稻产量相关基因LRK6等位基因的表达差异[D];复旦大学;2011年
9 李娟;安吉白茶高氨基酸性状相关基因的全长cDNA克隆及功能的初步研究[D];湖南农业大学;2011年
10 温景辉;基于SSR分子标记的山葡萄种质遗传多样性研究与核心种质构建[D];吉林农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张庆福;枳精氨酸脱羧酶基因(PtADC)转化烟草提高抗脱水研究[D];华中农业大学;2010年
2 魏礼玲;MYB转录因子家族相关EST干涉载体构建及遗传转化的研究[D];华中农业大学;2010年
3 张鲁军;离子束诱导普通小麦小偃81 HMW-GS 1Ax1缺失突变家系突变机制研究[D];郑州大学;2010年
4 刘无双;拟南芥种子特异表达基因启动子分析[D];山东农业大学;2010年
5 于军伟;苹果α-法尼烯合成酶基因转化番茄研究[D];山东农业大学;2010年
6 王京梅;叶籽银杏叶生雌性生殖器官发育相关基因的克隆与序列分析[D];山东农业大学;2010年
7 王妍;酸枣和西吕枣高频率不定梢诱导及酸枣遗传转化的研究[D];山东农业大学;2010年
8 郭梁;甜樱桃实生后代品质性状的遗传变异及远缘杂种根癌病抗性鉴定[D];山东农业大学;2010年
9 赵云霞;马铃薯L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因在番茄中的功能分析[D];山东农业大学;2010年
10 王晓菡;中国芍药品种遗传多样性SRAP分析和核心种质的初步构建[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李英,张鹤龄,哈斯阿古拉;马铃薯卷叶病毒中国株ORF1及5′端非编码区序列特点分析[J];病毒学报;2001年02期
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3 杨静华,哈斯阿古拉,梁成罡,张鹤龄;特异切割马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的核酶研究[J];病毒学报;1998年02期
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
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【二级参考文献】
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10 梁成罡,哈斯阿古拉,张鹤龄;马铃薯卷叶病毒复制酶基因3'端克隆及序列分析[J];病毒学报;1997年03期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 朱俊华;马铃薯Y病毒衣壳蛋白基因片段长度和结构对RNA介导抗病性的影响[D];山东农业大学;2003年
【相似文献】
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10 张磊;董家红;张仲凯;;马铃薯卷叶病毒RT-PCR-RFLP的检测分析[J];云南大学学报(自然科学版);2008年S1期
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9 王正荣;何畅;屈艺;王跃锜;周薇;;核酶对per节律基因表达的阻断作用的体内外研究[A];2004全国时间生物医学学术会议论文集[C];2004年
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中国重要报纸全文数据库 前3条
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2 李明军;河南师大发现怀山药病毒种类[N];中国医药报;2004年
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中国博士学位论文全文数据库 前9条
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2 吴茂森;大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因介导的抗病毒转基因小麦的研究[D];中国农业科学院;2000年
3 周薇;脱氧核酶阻断period1基因表达的体内外研究[D];四川大学;2005年
4 刘太国;BYDV-GPV株系正向串联体结构复制酶基因介导的转基因小麦研究[D];中国农业科学院;2003年
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6 徐章逸;两种葡萄卷叶伴随病毒的基因克隆、原核表达及葡萄遗传转化体系的初步建立[D];华中农业大学;2006年
7 温瑞;植物抗病毒基因工程研究 Ⅰ黄瓜花叶病毒复制酶基因表达载体构建和遗传转化 Ⅱ导入病毒基因的转基因植物释放的风险评估[D];浙江大学;2001年
8 吴家雪;人LC3B-β的鉴定及其对LC3B-α的负反馈调节机制[D];复旦大学;2006年
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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5 包常华;苜蓿花叶病毒复制酶基因不同片段介导的抗病性研究[D];内蒙古大学;2006年
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