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《中国农业大学》 2005年
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利用模式植物拟南芥鉴定和分离大丽轮枝菌外泌毒素中的致萎活性因子

刘实忠  
【摘要】:黄萎病是一种世界性病害,其寄主范围广,作用机理复杂,致病途径多样,难于防治,已成为严重影响以棉花为主的多种重要经济作物的产量与品质的重要真菌性病害。由于棉花等作物遗传背景复杂。很难在分子水平进行更深入的研究,另外黄萎病菌(大丽轮枝菌,Verticillium dahliae)小种分化变异性强等原因也为抗病遗传育种带来重重困难。建立拟南芥与大丽轮枝菌互作的模型,可以充分利用拟南芥这一模式植物的各种优势,促进病原菌与寄主植物互作的信号转导分子机制研究。已有的研究表明,黄萎病菌分泌的致萎毒素是导致寄主植物萎蔫的主要原因,而且毒素成分极为复杂。研究黄萎病菌分泌的致萎毒素的有效成分,获得拟南芥与病原微生物互作信号转导的详细信息,对全面了解抗病和感病反应机理、从而控制黄萎病的发生具有重要意义。 本论文研究工作的主要目的是利用拟南芥和大丽轮枝菌互作研究系统鉴定和分离病原菌分泌毒素中的活性致萎因子,以期为进一步鉴定克隆与活性致萎因子互作的寄主基因。论文实验工作主要是利用液相色谱和质谱等技术对黄萎病菌培养物外泌毒素进行分步深度纯化,通过接种拟南芥进行性状观察而检测各分离组分致萎活性。黄萎病菌液体培养的粗毒素经凝胶柱层析,得到2个有紫外吸收(OD_(280))的组分(P1和P2)。对这2个组分以及峰间无紫外吸收部分的致萎活性分析表明,其中P2组分具有明显的致萎活性。利用P2组分针刺成苗叶片或加入培养基对幼苗处理,结果均诱发与粗毒素处理一致的症状,使成苗叶片产生过敏性坏死斑点或抑制幼苗生长、使幼苗白化。针刺叶片实验还表明,P2组分处理诱导拟南芥病程相关蛋白PRl基因的表达,作为水杨酸信号途径的标记基因,PRI表达量在处理48小时达到最大。这说明P2具有外源激发子的作用。诱导拟南芥产生抗性。根据层析保留时间初步判定P2组分是小分子物质的混合物。利用离子交换色谱(IEX)对P2组分进一步分离纯化得到5个组分(D1~D5),其中D1组分的致萎活性明显强于其它组分。利用高效液相色谱(HPLC)对D1分析,得到一个有致萎活性的组分H112,对H112组分的质谱分析结果表明其小分子物质,化学分析表明可能含有糖基或类似物。对H112组分进行离子色谱(IC)分析获得6个活性组分,将这些组分进行反相高效液相色谱分析得到保留时间相似的活性组分。离子阱质谱分析表明其中一个活性组分IC4-1的主要成分是m/z520.7的片段。 本论文工作结合液相色谱、离子色谱和质谱分析及生物活性鉴定最终获得有致萎活性的小分子组分,为深入研究黄萎病病原与寄主植物互作的分子机理奠定了基础。
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