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《北京林业大学》 2011年
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秋水仙素诱导银杏2n雄配子低得率的机理研究

孙宇涵  
【摘要】:银杏(Ginkgo biloba L.)是目前现存的最古老的孑遗植物之一,具有广泛的栽培价值。但作为裸子植物其倍性育种一直是一个世界性难题,经过多年研究发现通过秋水仙素诱导可以产生银杏的2n雄配子,但其得率始终较低,还不足以用来进行后期的银杏多倍体植株的培育。本研究以银杏雄株生殖细胞为研究材料,通过利用高效液相色谱技术、紫外及荧光光谱技术、普通细胞学观察、免疫荧光染色技术和蛋白质组学双向凝胶电泳技术对秋水仙素诱导银杏2n配子低得率的相关机理进行了研究分析,为解决秋水仙素诱导银杏2n雄配子低得率这一问题提供理论依据。主要结果如下: 1)利用高效液相色谱技术对普通银杏雄株生殖细胞内的秋水仙素含量、银杏小孢子囊壁和小孢子母细胞壁膜对秋水仙素的阻碍情况、小孢子母细胞原生质对秋水仙素化学结构的影响以及这些因素对秋水仙素诱导银杏2n花粉得率的影响进行了深入的分析和科学的检测。研究表明:普通银杏雄株生殖细胞内并没有秋水仙素类物质生成;银杏小孢子囊壁和小孢子母细胞壁膜本身并不会明显阻碍秋水仙素的侵入;小孢子母细胞原生质对秋水仙素化学结构不会产生影响,即不会改变秋水仙素的化学结构。这说明以上几个因素都不是导致秋水仙素诱导银杏2n雄配子低得率的主要原因。 2)利用普通细胞学染色技术对经秋水仙素处理的银杏雄株生殖细胞的减数分裂进程进行了跟踪观察。观察发现:经秋水仙素处理的部分银杏雄株生殖细胞出现了明显的形成2n雄配子的趋势;秋水仙素作用干扰银杏雄株生殖细胞内染色体分离和移动的主要时段是在其减数分裂的第二次分裂时期;秋水仙素处理也导致了银杏雄株生殖细胞减数分裂发育进程的减缓或停滞。这说明秋水仙素对银杏雄株生殖细胞产生了作用,是能够诱导并产生银杏2n雄配子的,但经秋水仙素处理后的减数分裂减缓现象是否有利于银杏2n雄配子的诱导还需进一步的分析。 3)采用紫外及荧光光谱技术对秋水仙素与银杏小孢子囊蛋白的相互作用情况进行了分析。结果发现:银杏小孢子囊蛋白288nm处吸收峰值随秋水仙素作用浓度的增加而迅速增大,并发生吸收峰蓝移现象,但秋水仙素作用时间对此反应体系却没有明显的影响;278nm与295nm光激发时,秋水仙素作用后均引起银杏小孢子囊蛋白345nm处内源荧光的降低,并导致荧光发射峰的位置出现一定程度的蓝移。这说明银杏小孢子囊蛋白与秋水仙素接触的瞬间就与其发生结合反应,形成了一个稳定的缔合物,其构象也发生了一定的变化。 4)在银杏雄株生殖细胞的减数分裂时期,采用免疫荧光染色技术,跟踪观察了秋水仙素处理后其细胞微管的变化情况。观察发现:秋水仙素处理对银杏雄株生殖细胞内的微管结构产生了一定的影响,破坏了银杏雄株生殖细胞内的微管聚合-解聚的动态平衡,阻碍了微管的聚合,使早期的减数分裂细胞内的微管分布更加分散,并使中期阶段微管无法聚集在细胞两极区域形成成熟的纺锤体;但秋水仙素只能部分抑制和干扰银杏雄株生殖细胞的减数分裂进程,并不能使大量的银杏雄株生殖细胞减数分裂发生异常最终形成更多的2n雄配子。这说明秋水仙素的处理受到了银杏自身因素的干扰,这对秋水仙素诱导2n雄配子的最终得率产生了影响。 5)利用蛋白质组学双向凝胶电泳技术对经秋水仙素处理的银杏雄株生殖细胞的蛋白变化情况进行了分析。结果发现:秋水仙素处理银杏雄株生殖细胞2d后,银杏小孢子囊总蛋白种类和表达量与对照相比出现了明显的差异,在其凝胶电泳图像中出现了2个新的蛋白点,并有1个蛋白点消失;同时1个蛋白表达量升高,另有2个蛋白表达量降低。这说明在秋水仙素处理银杏雄株生殖细胞形成染色体加倍的2n雄配子的这个过程中某蛋白由于秋水仙素诱导而被激活或抑制,并通过协同作用使银杏雄株生殖细胞内生理生化进程发生了变化。结合秋水仙素诱导银杏2n雄配子的所得结果和前面所述的包括银杏小孢子囊壁和小孢子母细胞壁膜秋水仙素的阻碍性研究等在内的相关数据分析,可以推测银杏小孢子母细胞的蛋白质对秋水仙素诱导银杏2n雄配子的过程产生了影响,并可能最终导致了秋水仙素诱导银杏2n雄配子得率的降低。
【学位授予单位】:北京林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S792.95

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