兰属植物根部内生真菌及其对种子萌发苗木生长的效应

【摘要】：兰属(Cymbidium)植物是兰科(Orchidaceae)植物中最具观赏价值的类群之一。该属全世界近70种,其中有48种在中国境内广泛分布。 在自然生长状态下,兰科植物必须依赖与菌根真菌建立共生关系才能够生存。由于真菌对于兰科植物非常重要,对兰科植物根部内生真菌(包括菌根真菌)的研究一直是兰科植物研究的重要领域。掌握野生兰属植物内生真菌的多样性,对兰属植物的保育和产业化发展都具有非常重要的意义。 本研究选取在广西雅长兰科植物自然保护区、湖南新宁县、贵州兴义和云南大理不同生境下兰属的10种植物作为研究对象,包括春兰(C. goeringii)、寒兰(C. kanran)、莎叶兰(C. cyperifolium)、兔耳兰(C.lancifolium)、多花兰(C. floribundum)、硬叶兰(C. bicolor)、西藏虎头兰(C tracyanum)、建兰(C. ensifolium)、邱北冬蕙兰(C. qiubeiense)、莲瓣兰(C. lanpan)。对采集到的根段进行真菌的分离鉴定,并调查兰属植物分布区域的生长环境,对不同生境、不同生态类型的内生真菌多样性进行分析。同时以广西雅长兔耳兰种子和莎叶兰种子为材料进行室内种子共生萌发试验,以春兰组培根状茎、组培苗进行部分菌株的回接实验,讨论内生真菌与兰属植物的共生效应。主要结果如下： 1.从10种野生兰属植物根部共分离得到内生真菌菌株134个。结合真菌的形态观察与真菌ITS序列比对,对分离到的134个菌株进行鉴定,分别隶属于32个属：镰孢属(Fusarium)、角菌根菌属(Ceratorhiza)、毛壳菌属(Chaetomium)、丝葚霉属(Papulospora)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、交链孢属(Alternaria)、炭角菌属(Xylaria)、柱孢属(Cylindrocarpon)、拟茎点霉属(Phomopsis)、木霉属(Trichoderma)、瘤菌根菌属(Epulorhiza)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、胶膜菌属(Tulasnella)、念珠菌属(Monilia)、枝顶孢属(Acremonium)、单端孢霉属(Didymopsis)、柄孢壳菌属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、短梗梭孢霉(Fusoma)、黑孢霉属(Nigrospora)、生赤壳属(Bionectria)、简梗孢霉属(Chromosporium)、小菌核属(Sclerotium)、隔指孢属(Dactylella)、刺盘孢属(Colletotrichum)、间座壳属(Diaporthe)、蜡壳菌属(Sebacima)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、节菱孢霉属(Arthrinium)、多节孢属(Nodulisporium)、小丛壳属(Glomerella)。 2.将16种从兰属植物根部分离到的内生真菌制成液体诱导子和干菌丝诱导子,加入春兰组培物的培养基中进行诱导培养。每种诱导子做三个重复,每个重复作用于15个组培根状茎。同CK作对比,在生物量增长方面,CF1、CF10、CF11、CF12、CF15和CF16真菌诱导子与组培根状茎作用的效果最好,在鲜重的增长方面达到了非常显著的水平；在不定芽分化和组培物长势两个方面,CF10、CF11、CF15和CF16号诱导子作用效果比较好。通过在培养基质中加入浓度为Ⅰ=10g/L,Ⅱ=15g/L,Ⅲ=20g/L (ⅠⅡⅢ)的CF1、CF10、CF11、CF12、CF15和CF16号真菌诱导子表明：春兰组培物鲜重量随着诱导子浓度的增加而增加,当加入量增加到Ⅲ浓度时,组培物的鲜重与对照CK相比达到非常显著的水平,认为诱导子加入量的浓度为Ⅲ浓度时诱导效果好。同时,通过在培养基质中加入CF10、CF11、CF12、CF15和CF16号液体诱导子及干菌丝诱导子表明：春兰组培物不定芽的分化和组培物鲜重量在加入液体诱导子后效果较好。 3.从分离自兰属根部内生真菌中筛选出16个菌株与612个春兰组培根状茎进行回接实验,每个菌株6个重复,培养于燕麦和DE培养基上,并设立3个对照。接菌3-4月后对根状茎进行观察记录,并在接菌前后对其鲜重、茎长等指标进行记录。研究显示,燕麦培养基更适于根状茎与菌株的共生培养。CF1, CF2, CF4, CF5, CF7, CF11, CF12, CF13, CF15和CF16均能与根状茎共生。但对其有促生作用的CF1, CF7, CF11, CF15和CF16。 4.将117株已培养好的生理指标相似的春兰组培苗与16种分离自兰属根部的内生真菌进行共生培养,结果表明：菌株CF1、CF2、CF11、CF15和CF16使春兰苗鲜重的增长率增加非常显著。结合石蜡切片的观察结果及真菌的再分离结果,认为菌种CF1、CF2、CF13、CF15和CF16已于春兰组培苗形成了良好的共生体系,可作为春兰组培苗生长和繁殖的共生菌来应用。 5.将采集自广西雅长兰科植物自然保护区的兔耳兰、莎叶兰蒴果进行室内种子共生萌发实验,选用了16个供试菌株用于共生萌发实验。每个菌株做三个重复,并设立对照组。经3-4个月实验观察研究显示：CF1, CF3, CF4, CF6, CF10, CF13, CF15, CF16同对照相比较,均能够使兔耳兰种子膨大,CF4, C6及CF15的萌发率比较高；在接种CF6, CF7, CF153个月后,种子萌发的程度达到其种胚脱离种皮而且明显膨大。