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蛹虫草液体发酵虫草素纯化及抗菌抑癌活性分析

马婕馨  
【摘要】:蛹虫草作为一种食药用真菌,含有多种生物活性物质,在食、药、保健领域具有较为广泛的应用,于2014年批为新食品原料。虫草素作为蛹虫草产生的主要活性成分之一,目前存在虫草菌株传代培养退化严重,虫草素液体发酵条件尚需优化,分离纯化方法费时复杂,抑菌谱及抗癌活性不够明确等问题。本研究以蛹虫草为实验材料,探索液体发酵中虫草素提取方法,并进行相应的生物活性分析。主要研究内容及结果如下:(1)对收集保存的6株虫草菌株活化培养,通过ITS-r DNA序列测定和Gen Bank序列比对分析,复核6株菌均为蛹虫草。通过菌株液体发酵培养和蚕蛹接种培养,以菌丝体干重、超氧化物歧化酶活力、虫草素含量、子实体形态等为指标,确定YCC-W菌株及液体发酵用于生产获取虫草素。(2)对YCC-W菌株进行液体培养,通过单因素和正交实验,得到最适液体培养条件为:接种量4%、装液量100 m L/250 m L三角瓶、培养温度24℃、p H 5.5、培养天数25 d(先振荡3 d,转速150 rpm,之后静置培养至25 d);最佳培养基组成为葡萄糖20 g/L、鱼蛋白胨20 g/L、K_2HPO_41 g/L、Mg SO_40.5 g/L、Mn SO_40.5 g/L。经验证,发酵液中虫草素含量可达874.13μg/m L。(3)探索建立了一种经济简便的虫草素分离纯化方法:冻干的虫草发酵液粉末经甲醇溶解,离心,减压浓缩,加入蒸馏水(添加量以去除甲醇后虫草素能在液体中自然析出为标准)继续浓缩,抽滤,重复预冷蒸馏水复溶,抽滤等操作至沉淀呈白色,冷冻干燥获得纯化虫草素。经HPLC、MS、IR等方法定性定量检测,显示产物虫草素纯度高达94.26%。(4)虫草素对六种常见的革兰氏阳性(3 G~+)及阴性(3 G~-)细菌的抑菌研究显示,虫草素能显著抑制3种G~+菌的生长,对枯草芽孢杆菌的MIC为2.5 mg/m L,对苏云金芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌MIC均为5 mg/m L,进一步分析发现虫草素破坏细胞壁膜结构,引起胞内核酸泄露,导致菌体死亡;而0-10 mg/m L范围内的虫草素对大肠杆菌、肠沙门氏菌和铜绿假单胞菌等3种G~-菌没有表现出明显的抑制效果,推测虫草素的抑菌机理,对不同细菌(G~+G~-)细胞壁膜的组成具有一定的选择性。(5)通过体外抑癌实验,发现虫草素能显著抑制人结肠癌Caco-2细胞的增殖,IC_(50)为107.2μg/m L。激光共聚焦显微镜观察,显示虫草素引起Caco-2死亡及形态改变。流式细胞仪进一步分析,发现虫草素可诱导Caco-2发生早期凋亡,细胞周期在G2期发生阻滞;在一定范围内,Caco-2细胞凋亡和细胞周期阻滞现象均呈现剂量依赖性。本研究获得蛹虫草发酵、提取、分离、纯化虫草素的方法,解析了虫草素对6种常见G~+与G~-菌的抑菌谱及作用机理,体外实验证明虫草素可抑制人结肠癌Caco-2细胞增殖、破坏细胞形态;结果为进一步开发利用虫草素提供参考。


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