转双价基因促进植物生根及顶端优势的研究

【摘要】：我国有许多树种特别是一些珍贵树种，由于其自身的生理特点，有性繁殖困难，硬枝扦插生根困难，严重影响了这些优良树种的推广和应用。例如我国西北沙漠地区的胡杨、青藏高原地区的银白杨、黄土高原地区的河北杨以及华北平原的名优树种毛白杨等均属此类。 利用发根农杆菌Ri质粒转化植物材料是促进植物扦插生根的有效方法，但是这些转基因植物同时也产生了比较严重的表型变异。如顶端优势削弱、节间缩短、雄性不育、早熟等。而研究结果表明，Ri质粒中的rolB基因单独表达能够诱导形成大量的毛根，而且转基因植物形态变异较少，但存在矮化现象。赤霉素(Gibberellins，GAs)是植物生长发育过程中一类重要的调节激素。促进植物的顶端优势是赤霉素最主要的生理功能。随着赤霉素突变体的大量发现，目前已经确认GA20-氧化酶是赤霉素代谢途径中最重要的反馈调节中心之一。 本研究论文首次构建了由rolB及pttGA20ox两个基因组成的双价基因植物表达载体；并优化了烟草新基因型W38的转化受体系统，对其进行了抗生素敏感性实验，确定了最优的遗传转化条件及抗生素的筛选浓度；在首次利用高保真的pfu与pyrobest DNA聚合酶构建rolB及pttGA20ox单价基因植物表达载体的基础上，构建了由这两个基因组成的双价基因植物表达载体；利用叶盘法由农杆菌介导对烟草进行了遗传转化，通过抗生素、PCR和PCR-Southern blot等方法对转化的烟草进行了鉴定；并对获得的三种转基因烟草组培苗进行了生根、顶端优势及形态变异分析。通过转化模式植物来验证同时转化rolB及pttGA20ox两个基因促进植物生根及顶端优势的可行性。 研究结果表明：烟草W38的转化受体以叶片最为合适，在筛选的MS+2.0mg／L6-BA+1.0mg／L NAA分化培养基上叶片分化的效率最高，接种叶片平均再生芽数达到15.7个；筛选烟草抗性芽的抗生素浓度以Kan 75-100mg／L或G418 50-80mg／L最佳：烟草遗传转化时菌液浓度以OD_(600)值0.5转化效率最高，分化培养基中添加200 umol／L的AS(乙酰丁香酮)能够使烟草的转化率达到20％以上；推迟培养4-7天有利于减少假阳性苗的出现。 从三种转基因烟草的功能来看：转rolB及双价基因烟草的生根时间比对照及单 转双价基因促进植物生根及顶端优势的研究 转单价PttGAZ口ox基因的烟草提前了3一5天，生根的数量及长度也有明显增强;转 PttGA20ox及双价基因烟草的生长状况明显高于对照和转rolB基因烟草，其方差分析 也达到了极其显著的水平;转双价基因的烟草在顶端优势及生根能力方面同时具备了 转单个rolB及PttGA20ox基因烟草的特征。 实验结果证明:利用基因工程技术同时转化rolB及PttGA 20ox两个基因促进植物 的扦插生根及顶端优势是可行的;所构建的pBin19rolB及PBll21GA单价基因表达 载体及pBinrolBGA(PBinGR)双价基因植物表达载体插入位点正确、基因功能正常。 本研究内容不仅对研究植物根形态发生和植物生长发育有重要的理论意义，而且可为 选育扦插生根能力强、顶端优势又不被削弱的转基因林木新品系奠定基础。