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《北京林业大学》 2005年
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草地早熟禾高频再生体系的建立及基因枪导入甜菜碱脱氢酶基因的研究

段碧华  
【摘要】:通过草地早熟禾组织培养的最佳条件和体细胞胚胎发生的影响因素的研究,建立了草地早熟禾的组织培养的高频再生体系;优化了草地早熟禾的基因枪转化技术参数,并利用基因枪轰击法将山菠菜的甜菜碱脱氢酶基因导入草地早熟禾,并稳定地整合到草地早熟禾基因组中,经耐旱耐盐试验初步证实了转基因植株的耐旱和耐盐性有所提高。 1、通过外植体筛选、不同激素浓度配比试验,对草地早熟禾5个品种愈伤组织诱导、器官分化、壮苗生根影响因素进行了研究,发现用ABA代替CH有利于愈伤组织的质量和诱导率的提高,建立了一套以“新哥莱德(Nuglade)”成熟种子为主基因型的草地早熟禾高频再生组织培养体系。即: 诱导培养基:MB5+2mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA(或0.5mg/LKT)+2mg/LABA+12mg/L gelrite+60mg/L蔗糖 继代培养基:MB5+0.5-1mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA(或0.5mg/LKT)+2mg/LABA+12mg/L gelrite+60mg/L蔗糖。 分化培养基:MB5+3mg/L6-BA(或2mg/LKT)光下培养。 生根培养基:1/2MS+IAA0.8mg/L。 培养条件:25±1℃暗处培养暗培养3~4周,转移到愈伤组织继代培养基上光照培养。白天25±1℃,夜晚18±1℃,光强1500-2000LUX,光照时间16h/d。 2、通过对轰击压力、轰击次数、轰击距离、不同金粉及DNA的纯度和浓度等因素的研究,优化了草地早熟禾的基因枪转化技术参数。每轰击一枪后转动培养皿的方向,并翻动受体材料有利于转化效果的提高。在选用1100psi压力膜、6cm的轰击距离、使用250ug金粉吸附0.5ug pBIN438质粒DNA的用量和轰击两枪下转化性价比最好。 3、通过对草地早熟禾愈伤组织标靶材料筛选、高渗溶液处理、继代培养、轰击后恢复培养等进行研究,结果表明:作为转化受体,在所选用的实验材料中,新哥莱德(Nuglade)再生能力强,获得转基因植株的频率较高,是较好的转化标靶材料;在基因枪轰击前,用含0.5M甘露醇的分化培养基预处理10~24h,有助于提高转化效率;发现草地早熟禾愈伤组织的继代时间应在3个月以内,尽量缩短抗性愈伤的筛选
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