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甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因克隆及结构分析与功能鉴定

林元震  
【摘要】: 甜杨(Populus suaveolens)属杨柳科(Salicacae)杨属(Populus L.)青杨派(Section Tacamahaca)树种,分布于北美、亚洲。在中国,甜杨主要分布于大兴安岭北部及漠河一带,分布区的年平均气温为-3.8 oC,冬季气温为-40.5~-27.4 oC,极端最低气温为-46.9 oC,是研究木本植物抗冻性及有关抗冻基因克隆的理想材料。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)是磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶,其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH,也为核酸合成提供戊糖;此外,还参加非生物逆境胁迫应答反应。因此,G6PDH对植物的生长发育起着非常重要的作用。前期研究表明,低温下G6PDH活性的提高与甜杨抗冻性密切相关。本研究以耐极低温的高大乔木甜杨为试材,建立了其无菌离体培养体系,采用不同方法制备总RNA,并通过RT-PCR和E-PCR相结合的方法进行甜杨G6PDH基因(PsG6PDH)的分离克隆。在此基础上,利用生物信息学手段对获得PsG6PDH基因进行结构分析及功能预测,并开展了PsG6PDH的原核表达及其表达条件优化的研究,以验证目的基因编码框的完整性。最后,构建了PsG6PDH的植物表达载体并导入烟草,通过低温抗性实验以及电导率、SOD活性、POD活性和MDA含量等理化指标的测定,从中探讨PsG6PDH在转基因烟草耐低温中的可能作用。通过上述研究可得到以下结果: 1.以茎段为外植体,首次建立了甜杨的离体培养体系。甜杨最佳启动培养基为改良MS附加BA 0.5mg/l、NAA 0.1mg/l,获得无菌苗后,继代培养基为改良MS附加6-BA 0.5mg/l、NAA 0.1mg/l和GA 0.1mg/l,生根培养基为1/4改良MS附加NAA 0.1mg/l和GA 0.1mg/l,叶片分化培养基为改良MS附加BA 2.0mg/l和NAA 0.1mg/l。 2.首次克隆了甜杨G6PDH的基因,这也是第一个从杨树中分离到的G6PDH基因。利用E-PCR和RT-PCR成功地从甜杨中分离了G6PDH的全长基因(PsG6PDH),其长度为1697 bp,可编码510个氨基酸,而且核酸序列及其推导的氨基酸序列均与植物G6PDH具有较高的同源性。同时,运用PCR扩增技术获得了甜杨G6PDH基因组序列,测序结果表明,基因组DNA长度为5040 bp,含有14个外显子和13个内含子。Southern杂交结果表明,G6PDH基因在甜杨的基因组中可能是单拷贝或者低拷贝。 3.采用Antherwin 5.0软件分析了PsG6PDH的理化特性,并运用Clustal X1.83软件构建了PsG6PDH的系统进化树,结果表明,甜杨PsG6PDH为易溶、亲水性强的蛋


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