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山核桃分子标记与开花基因CcLFY及其启动子克隆的研究

王正加  
【摘要】: 山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是我国特有干果和木本油料树种,主要分布在浙皖交界天目山系29°~31°N, 118°~120°E,浙西北山区近7万农户从事山核桃生产经营,70%以上的收入来源于山核桃。研究山核桃分子标记和克隆开花相关基因及其启动子,为其良种选育提供新的理论基础和途径,为培育缩短童期提早开花结实的新品种奠定分子育种基础,对该重要经济树种改良具有重要理论和实际意义。本文利用RAPD分子标记技术分析中国山核桃属6种植物间亲缘关系、5个山核桃和3个大别山山核桃天然种群遗传多样性;利用AFLP技术分析山核桃与薄壳山核桃杂交F1代的遗传变异;以常规分子生物学技术和锚定PCR技术分别克隆山核桃开花基因CcLFY及其启动子,并在GenBank注册,主要结果如下: 1、中国山核桃属6种植物间亲缘关系研究表明:20个引物共扩增检测到317条谱带,平均每个引物扩增15.58条,其中271条谱带表现出多态性,占总带数的85.5%。POPGEN32软件分析显示:山核桃属6种植物间,遗传距离最小为0.2216,存在于山核桃和湖南山核桃之间,表明二者亲缘关系最近;遗传距离最大为0.5440,存在于湖南山核桃与薄壳山核桃之间,表明两者亲缘关系最远。5个山核桃树种天然群体和3个大别山山核桃天然群体RAPD分析表明:20对10bp随机引物扩增共检测到252条和238条谱带,其中多态带为168和162条,占66.7%和68.1%。遗传多样性分析结果显示:Shannon多样性指数为0.4102和0.4761,说明60.32%和58.18%的变异分布于群体内,而种群间变异占39.68%和41.82%,表明种群内有较丰富的遗传变异;这为良种选育提供了理论依据。 2、利用AFLP技术对山核桃与薄壳山核桃授粉子代进行了分析,结果表明:父本与母本和子代之间有明显的差异,但母本与子代之间没有存在任何差异。 3、我们根据已注册的开花调控关键基因LEAFY(LFY)同源基因的保守序列设计特异性引物,克隆到山核桃LFY同源基因片段基础上,以3’和5’RACE克隆获得山核桃LFY同源基因CcLFY全长cDNA,1442bp,已在GenBank注册,注册号为DQ989225。其中,开放阅读框(ORF) 1158 bp,编码385个氨基酸(包括起始密码子ATG)和一个终止密码子TAA,推测其分子量为43.5KD。cDNA序列中包含有脯氨酸富集区、中央酸性域、亮氨酸拉链结构及由赖氨酸和精氨酸残基形成的碱


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