长鞭红景天细胞悬浮培养及其次生代谢调控研究
【摘要】：
药用植物长鞭红景天(Rhodiola fastigiata S.H.Fu)的根及根茎含有的以红景天甙(salidroside)为主的次生代谢物(secondary metabolite)具有抗疲劳、抗衰老、抗缺氧、抗微波辐射及抗肿瘤等功效，是极具开发前景的环境适应药物之一。由于受到社会需求的迅猛增长和生态环境的日渐退化等因素的影响，长鞭红景天的野生资源量急剧下降，物种几近灭绝。为探寻新的资源补偿途径，本研究以植物细胞培养技术为手段，以野生长鞭红景天植株的茎、叶为外植体，首先开展了颗粒状愈伤组织(granule calli)高产无性系和悬浮培养高产细胞系的筛选工作。以筛选出的高产细胞系为研究对象深入探讨了其形态特征(morphological characteristics)、生长规律(growth pattern)，以及主要药效成分(medicinal composition)红景天甙的合成及累积状况，并进而考察了培养基组分构成(constituent of culture media)及温度、光、pH等培养条件对细胞生长、目标产物生产的影响。通过改变光强和照光时间，重点研究了不同波长的光量子对长鞭红景天悬浮培养细胞中红景天甙生物合成途径的上游限速酶苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase；PAL)生物活性的影响，以及由此引起的主要细胞内含物的含量变化。
本研究构建的长鞭红景天细胞悬浮培养体系，在细胞增殖、次生代谢能力等部分生物学性状表达上都较原型细胞更为强盛。其中，平均生物量可提高3.23倍，生长周期延长至24d左右，而且红景天甙生物合成能力加强，持续合成时间延长至细胞生长末期，累积量约为原型的2.72倍。此外，该体系的细胞结构更为致密，而且细胞呈绿色，含有少量的叶绿体色素分子，这为研究光合自养型细胞(photoautotrophic cells)的生物学特征、生理生化特征等提供了可能。
为深入了解长鞭红景天悬浮培养细胞体系的生物学特征，采用单因素变化法对其培养条件及生长所需要的营养物质进行了优化研究。结果表明：MS可作为细胞生长量和红景天甙产出量的最适基本培养基；利于生物量累积的碳源(蔗糖)水平为30mg／L，而利于红景天甙累积的碳源水平较高(50mg／L；在总氮量不变的前提下，NH_4+／NO_3~-为1:2时体系的生长和生产能力最强，但单就红景天甙的产出而言，总氮量为MS基本培养基的1／2时效果最佳)，说明高的C／N比有利于红景天甙的合成。
由于野生植株源于西藏高寒山区，在13℃的冷激处理中，长鞭红景天悬浮培养细胞同样亦表现出了较高的适应性响应水平，此时的红景天甙产额较25℃室温条件下增长了39.25％，而37℃下却降低了16.21％。可见，在高温诱导下，红景天甙累积能力被削弱。
不同波长光量子对红景天甙生物合成的调控研究发现，红光对关键酶PAL活性的诱导作用最强，但是这种诱导效应会随光强的进一步增加而达到饱和；相对而言，440nm的蓝光对PAL活性的增效作用不明显，且胞内可溶性糖含量较660nm和400nm下低。
本论文首次针对一种高海拔恶劣环境下生存、生长良好的药用植物的悬浮细胞开展深层次研究，所取得的研究成果可为进一步探究非模式植物的次生代谢调控机制，以及目标代谢产物的生物生产奠定基础。研究所建立的实验体系还可为更深层次的次生代谢功能基因组学及代谢组学研究提供支持。
【关键词】：长鞭红景天 红景天甙 悬浮培养 高产细胞系 光质 PAL活性 【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S567.239
【目录】：
- 摘要3-5
- ABSTRACT5-7
- 目录7-9
- 1 引言9-31
- 1.1 植物次生代谢途径及其调控机制研究进展9-18
- 1.1.1 萜类化合物10-13
- 1.1.2 生物碱类13-15
- 1.1.3 苯丙烷类化合物15-18
- 1.2 红景天甙生物合成与PAL酶的调节研究18-22
- 1.2.1 红景天甙的生物合成18-19
- 1.2.2 PAL酶学性质研究19-22
- 1.3 植物高产细胞系筛选方法的研究22-24
- 1.4 红景天属植物研究进展24-26
- 1.4.1 药用历史24
- 1.4.2 化学成分及药理作用24-26
- 1.5 西藏红景天属植物资源26-27
- 1.6 研究目的及意义27-28
- 1.7 研究内容28-29
- 1.8 研究技术路线29-31
- 2 愈伤组织中红景天甙提取方法优化31-39
- 2.1 材料与方法32-33
- 2.1.1 植物材料32
- 2.1.2 仪器设备32
- 2.1.3 化学试剂32
- 2.1.4 红景天甙含量的检测32-33
- 2.1.5 实验方法33
- 2.2 结果与讨论33-37
- 2.2.1 愈伤组织红景天甙成分检测33-34
- 2.2.2 微波处理时间优化34-35
- 2.2.3 提取溶剂优化35-36
- 2.2.4 提取时间优化36
- 2.2.5 微波破细胞提取法与热回流提取方法的比较36-37
- 2.3 小结37-39
- 3 高产无性细胞系筛选及悬浮培养体系构建39-51
- 3.1 材料与方法41-43
- 3.1.1 实验材料41
- 3.1.2 实验方法41-42
- 3.1.3 测定方法42-43
- 3.2 结果与讨论43-50
- 3.3.1 高产细胞系原型愈伤组织红景天甙含量的初步鉴定43-44
- 3.3.2 高产细胞系原型愈伤组织状态调控44-47
- 3.3.3 CCA型颗粒状愈伤组织悬浮培养体系的建立47-50
- 3.3 小结50-51
- 4 细胞悬浮培养生长及生产培养基的优化51-71
- 4.1 材料与方法51-54
- 4.1.1 实验材料51
- 4.1.2 实验方法51-54
- 4.2 结果与讨论54-69
- 4.2.1 颗粒型愈伤组织中叶绿素的含量54-55
- 4.2.2 培养基组分对悬浮细胞生长及红景天甙合成的影响55-64
- 4.2.3 培养条件对悬浮细胞生长及红景天甙合成的影响64-69
- 4.3 小结69-71
- 5 红景天甙生物合成及其代谢酶PAL的活性调控71-87
- 5.1 材料与方法72-75
- 5.1.1 实验材料72
- 5.1.2 培养方法72
- 5.1.3 实验方法72-75
- 5.2 结果与分析75-83
- 5.2.1 悬浮培养细胞生长及PAL活性的动态变化75-77
- 5.2.2 光质对悬浮培养细胞生长及PAL活性的影响77-79
- 5.2.3 光强及照光时间对悬浮培养细胞生长及PAL活性的影响79-83
- 5.3 小结与讨论83-87
- 6 结论与展望87-89
- 6.1 主要结论87-88
- 6.2 展望88-89
- 参考文献89-99
- 附表:西藏红景天属植物名录99-101
- 图版一101-102
- 图版二102-103
- 注释说明清单103-104
- 导师简介104-105
- 个人简介105
- 发表论文目录清单105-106
- 致谢106
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