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《北京林业大学》 2008年
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二月兰遗传多样性研究

张莉俊  
【摘要】： 二月兰(Orychophragmus violaceus)在我国分布十分广泛,容易繁殖,具有极高的利用价值,是集食用、保健、饲用和观赏于一身的优良地被植物。二月兰遗传背景简单、生长周期短,具有非常丰富的性状变异,还是发展模式植物的优良材料。为了探讨二月兰性状变异与基因组间差异的相关性,了解形态性状变异的内在机制,从而进一步开发其育种价值,本研究在分析二月兰生物学特性的基础上,从形态性状、核型参数和分子标记三个层次对分布于北京、南京和上海不同地区的二月兰居群进行了遗传多样性研究,期望为二月兰种质资源的考察、收集和合理利用提供依据,为二月兰今后的育种及栽培、种下等级的划分和进一步的遗传研究以及品种培育提供一定的参数资料。本研究的结果如下: 1.生物学特性的研究主要包括二月兰在北京地区开花的物候期、花粉的活性、柱头的可授性、植株繁育系统及种子的萌发特性等。二月兰的花期从3月底可一直到5月中旬,盛花期在4月,单朵花期维持5天左右,5月中旬花瓣基本凋谢,进入结实期;花粉活性蕾期最高,开花第4天基本无活性,而柱头可授性在开花后3-4天最高;繁育系统检测的结果也表明:二月兰自然条件下以异花授粉为主;二月兰的种子储藏年限及温度对萌发率有一定的影响,尤其对萌发速度影响较大,2005年收集的种子相较于2003年和2004年萌发更快,而在25℃下萌发速度比20℃和30℃更快。 2.形态性状分析本研究共选取了北京和南京地区7个居群的34个表型性状进行观测。通过计算分析发现:株高、茎和花序分枝等性状受环境影响较大,因而其分类价值不大;叶形、毛被、叶缘锯齿等性状的变异在居群内是连续的,是不可靠的分类性状;而花部性状的一些变异,包括花瓣的颜色、大小、形态,基本不受环境影响,且这些变异在居群内是不连续的,所以具有相对较高的分类价值。对17个数值性状的方差分析和多重比较结果表明,在同一年度内,大部分性状在不同地区间差异不显著,在居群间差异极显著;而在不同年度内,居群间差异不显著。最后,对7个居群和30个表型性状进行了数量分类:Q分析表明北京颐和园BYH、南京紫金山山顶公园NZJ和南京中山植物园NZS居群比较相似,而北京圆明园BYM、北京海淀区后八家苗圃BH、南京情侣园NQ和北京天坛公园BT居群较相似。R分析表明:二月兰花部、叶部、反映植株毛被和颜色以及表现植株生长量的性状间均具有一定的相关性。 3.核型分析选取了二月兰在北京地区的四个居群:后八家、天坛、颐和园和圆明园,对其染色体类型进行了初步分析。得出以下结论:(1)二月兰的体细胞染色体组成复杂,其中以2n=2x=24的细胞居多,四个居群的核型分别为:后八家居群2n=2x=24=4sm+20m;天坛居群2n=2x=24=24m;颐和园居群2n=2x=24=6sm+18m;圆明园居群2n=2x=24=24m。(2)在二月兰细胞核中出现了较高频率的B染色体,数目为1、2、3不等。(3)在四个居群中,分别观测到染色体的整倍体和非整倍体变异,其数目从5、6、8、9、12、13、14、15、18、19、20不等。以上结果表明:二月兰在长期的系统发育过程中染色体水平上发生了一定程度的变异。 4. ISSR分子标记研究利用ISSR分子标记对9个二月兰居群共245个个体的遗传多样性水平及居群遗传结构进行了分析。8个ISSR引物共扩增出162条谱带,多态性条带150条,多态性比率为93.59%。POPGENE分析结果表明:二月兰总遗传多样性Ht为0.4005。在物种水平上He=0.4242,I=0.6103;在居群水平上,平均多态性位点比率PPB为87.02%,He=0.3464,I=0.5150。Nei′s遗传多样性分析和AMOVA分析表明:居群间基因分化系数GST为0.1643,居群内的基因多样性占总群体的80.80%,居群间占16.43%,地区间占2.77%。居群间的基因流Nm为2.5760。根据居群间遗传相似系数进行UPGMA聚类,结果表明:9个居群被聚为3大类群,北京地区的4个居群单独聚为一类,南京和上海的居群间没有明显的区分,居群的遗传多样性与地理、生态因子相关性不大,没有发现居群间的显著分化。 5.二月兰遗传多样性的综合分析 综合以上的研究结果表明:(1)二月兰分布广,在中国东北、华北、华东、华中及西北地区均有分布。二月兰的整体花期较长,可维持一个多月,属于异花授粉植物,主要通过风和昆虫来进行传粉。(2)二月兰具有丰富的遗传多样性,且居群内的遗传多样性高于居群间的,说明居群内的变异是二月兰变异的主要来源。(3)二月兰的繁殖系统和居群间较大的基因流导致居群间的遗传分化不显著,地区间的差别则更小。(4)不同居群的聚类分析在一定程度上反应出居群间的相关性,来自不同地区的居群间差异比来自同一地区的要大,说明地理来源相同的材料,其亲缘关系较近。
【关键词】：二月兰 生物学特性 居群 遗传多样性 表型性状 核型 ISSR
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：S682.31
【目录】：
  • 摘要3-5
  • ABSTRACT5-12
  • 1 绪论12-44
  • 1.1 植物遗传多样性研究的理论与方法12-25
  • 1.1.1 遗传多样性的概念及其产生的遗传基础12-13
  • 1.1.2 遗传多样性研究的意义13-14
  • 1.1.3 影响物种遗传多样性与遗传结构的因素14-17
  • 1.1.3.1 影响物种遗传变异的因素14-15
  • 1.1.3.2 影响物种遗传结构的因素15-17
  • 1.1.4 遗传多样性的检测方法17-25
  • 1.1.4.1 形态水平17-19
  • 1.1.4.2 染色体水平19-21
  • 1.1.4.3 蛋白质水平21-22
  • 1.1.4.4 分子标记技术22-25
  • 1.2 野生植物资源的开发研究25-32
  • 1.2.1 开发野生植物资源的重要意义25-26
  • 1.2.2 我国野生植物资源的研究与开发26-31
  • 1.2.2.1 研究现状26-27
  • 1.2.2.2 主要研究内容27-31
  • 1.2.3 小结31-32
  • 1.3 二月兰的研究进展与开发应用32-40
  • 1.3.1 二月兰的形态特征与地理分布32-33
  • 1.3.2 二月兰的研究进展33-35
  • 1.3.2.1 诸葛菜属的种界划分33
  • 1.3.2.2 二月兰的生物学研究33-34
  • 1.3.2.3 二月兰的细胞学研究34-35
  • 1.3.2.4 二月兰的遗传学研究35
  • 1.3.2.5 二月兰的育种学研究35
  • 1.3.3 二月兰的开发价值35-38
  • 1.3.3.1 优良的早春地被植物35-36
  • 1.3.3.2 经济价值36
  • 1.3.3.3 观赏价值36-38
  • 1.3.3.4 生态效益38
  • 1.3.4 二月兰的园林应用38-40
  • 1.3.4.1 整体效果的应用38
  • 1.3.4.2 二月兰与植物的配置38-39
  • 1.3.4.3 二月兰与山石、建筑、水体及园路的配置39-40
  • 1.3.5 小结40
  • 1.4 本研究的目的与意义、主要内容及技术路线40-44
  • 1.4.1 目的意义40
  • 1.4.2 研究的主要内容40-41
  • 1.4.3 创新性41
  • 1.4.4 技术路线41-44
  • 2 二月兰的生物学研究44-56
  • 2.1 材料与方法44-46
  • 2.1.1 物候期观察44
  • 2.1.2 种子萌发特性44-45
  • 2.1.2.1 温度梯度44
  • 2.1.2.2 年份梯度44-45
  • 2.1.3 传粉生物学45-46
  • 2.1.3.1 花粉活性的检测45
  • 2.1.3.2 柱头可授性检测45-46
  • 2.1.3.3 繁育系统检测46
  • 2.2 试验结果46-51
  • 2.2.1 二月兰的生长发育规律46-48
  • 2.2.1.1 二月兰的营养生长发育规律46-47
  • 2.2.1.2 二月兰的生殖生长发育规律47-48
  • 2.2.2 种子的萌发特性48-50
  • 2.2.2.1 温度梯度48-49
  • 2.2.2.2 年份梯度49-50
  • 2.2.3 二月兰的传粉生物学特性50-51
  • 2.2.3.1 花粉活性与柱头可授性50-51
  • 2.2.3.2 繁殖系统51
  • 2.3 讨论51-56
  • 2.3.1 不同地区二月兰的生长发育节律51-53
  • 2.3.2 播种繁殖的注意事项53
  • 2.3.3 二月兰传粉机制的探讨53
  • 2.3.4 二月兰的繁育系统与进化53-54
  • 2.3.5 传粉方式与二月兰的适应性54-56
  • 3 二月兰形态性状的表型分析56-68
  • 3.1 材料和方法56-58
  • 3.1.1 取样方法56
  • 3.1.2 性状选取56-57
  • 3.1.3 形态特征的观测与记录57
  • 3.1.4 数据处理57-58
  • 3.2 结果58-65
  • 3.2.1 主要描述性性状的变异58
  • 3.2.2 居群内形态变异系数的分析58-62
  • 3.2.3 居群间形态变异的方差分析62
  • 3.2.3.1 地区和居群间的双因素巢式方差分析62
  • 3.2.3.2 年份和居群间的双因素方差分析62
  • 3.2.4 聚类分析62-65
  • 3.2.4.1 Q 型聚类分析62-65
  • 3.2.4.2 R 型聚类分析65
  • 3.3 讨论65-68
  • 3.3.1 性状的变异式样与分类价值65-66
  • 3.3.1.1 茎部性状65
  • 3.3.1.2 叶部性状65-66
  • 3.3.1.3 花部性状66
  • 3.3.2 二月兰形态变异的水平与格局66
  • 3.3.3 二月兰形态变异机理的分析66-67
  • 3.3.4 性状的育种学价值67-68
  • 4 北京地区二月兰4 个居群的核型分析68-80
  • 4.1 材料和方法68-71
  • 4.1.1 试验材料68
  • 4.1.2 试验的方法与步骤68-71
  • 4.1.2.1 二月兰种子的萌发68-69
  • 4.1.2.2 常规染色体压片的制备69-70
  • 4.1.2.3 核型统计的方法70-71
  • 4.2 结果与分析71-76
  • 4.2.1 种子萌发的最佳方法71
  • 4.2.2 二月兰染色体标本的制备71-72
  • 4.2.3 各居群的核型分析72-76
  • 4.2.3.1 后八家居群的核型分析72-73
  • 4.2.3.2 天坛居群的核型分析73
  • 4.2.3.3 颐和园居群的核型分析73
  • 4.2.3.4 圆明园居群的核型分析73-76
  • 4.3 讨论76-80
  • 4.3.1 二月兰核型多态性76
  • 4.3.2 B 染色体76-77
  • 4.3.3 多倍体假说77-78
  • 4.3.4 非整倍体染色体78-79
  • 4.3.5 二月兰核型参数变异的水平79
  • 4.3.6 二月兰进化位置的探讨79-80
  • 5 二月兰遗传多样性的ISSR 分析80-94
  • 5.1 实验仪器及试剂80-82
  • 5.1.1 实验仪器80
  • 5.1.2 实验试剂及来源80-82
  • 5.2 材料与方法82-87
  • 5.2.1 试验材料82
  • 5.2.2 DNA 提取82-84
  • 5.2.3 ISSR-PCR 扩增84-86
  • 5.2.4 电泳结果统计与分析86-87
  • 5.3 实验结果87-91
  • 5.3.1 DNA 提取结果87
  • 5.3.2 二月兰ISSR－PCR 反应体系的建立87-88
  • 5.3.2.1 正交试验结果分析87
  • 5.3.2.2 各因素对PCR 反应影响的差异分析87-88
  • 5.3.2.3 退火温度的确定88
  • 5.3.3 二月兰物种和群体水平的遗传多样性88-90
  • 5.3.4 居群遗传分化程度的比较分析90-91
  • 5.3.5 二月兰不同居群的遗传距离及聚类分析91
  • 5.4 讨论91-94
  • 5.4.1 ISSR 的稳定性及用于遗传学分析的可行性91-92
  • 5.4.2 二月兰的遗传多样性92-93
  • 5.4.3 二月兰的遗传分化93-94
  • 6 结论与建议94-98
  • 6.1 三种标记方法的综合分析94-95
  • 6.2 结论95-96
  • 6.3 建议96-98
  • 参考文献98-114
  • 个人简介114-116
  • 导师简介116-118
  • 致谢118-120
  • 附录：ISSR 分子标记图谱120-126

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