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《北京林业大学》 2008年
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多年生黑麦草基因转化与抗旱性遗传改良研究

李雪  
【摘要】: 本研究通过建立多年生黑麦草(Lolium perenne L.)高频再生体系,应用基因枪和农杆菌介导法将DREB1A和BADH-CMO基因导入胚性愈伤组织,获得正常生长的抗性增强的可育转基因植株;通过人工授粉和自由杂交方式获得转基因子代,并研究了其萌发、盆栽和田间生长特性;建立了快速检测多年生黑麦草转基因植株潮霉素(hyg)抗性的方法和抗旱子代筛选体系;综合评价了转基因多年生黑麦草的安全性。通过5年多的研究,在以下几个方面取得了进展: 1、选择适宜品种,以胚为外植体,建立多年生黑麦草高频再生体系,使愈伤诱导率达到97.9%,胚性愈伤率达到19.4%,分化率可达90.9%。 2、建立起多年生黑麦草遗传转化筛选系统:愈伤培养阶段添加hyg 100mg/L,筛选30d;植株再生阶段50mg/L,筛选至有芽长出后移入不含hyg的生根培养基中。农杆菌介导转化时以头孢霉素(cef)为抑菌剂,愈伤培养阶段添加300mg/L,植株再生阶段250mg/L。 3、建立多年生黑麦草基因枪遗传转化体系:以0.5~1mm间的胚性愈伤组织为受体,金粉直径1μm,采用Ca(NO3)2+PEG4000作为DNA沉淀剂,6cm高度下轰击2次。获得转DREB1A基因爱神特转基因株系(ATR)68个,特拉华转基因株系(DTR)7个,尤文图斯转基因株系(JTR)18个;转BADH-CMO基因爱神特转基因株系(ABC)15个,三个品种的平均抗性绿苗率为11.1%。 4、建立多年生黑麦草农杆菌介导遗传转化体系:以预培养5d的胚性愈伤组织为受体,采用OD600=0.1左右的农杆菌菌液侵染10min,期间进行抽真空和晃动处理。去除菌液后,共培养4d,以500mg/L cef清洗后筛选,获得转DREB1A基因爱神特转基因株系(AGR)14个。 5、转基因多年生黑麦草在温室和田间均可正常生长,盆栽ATR、AGR和ABC较ACK生长速度减慢,田间ATR、AGR、JTR、DTR与对照植株无明显差异,但ABC的生长受到严重抑制。外源基因的插入不仅使转基因植株的抽穗时间提前,还导致其穗长变短,尤其是BADH-CMO基因显著降低了ABC的穗长。DREB1A基因使转基因植株的抽穗个数略有提高,而BADH-CMO基因则使其显著降低。转基因植株较对照植株具有更高的抗旱、越冬和耐盐性,但抵御病害的能力明显下降,在对抗虫害方面二者无明显差异。除ABC外,转基因植株均能结实。 6、采用人工授粉和隔离杂交两种方式获得大量转基因子代,T1代种子具有较高的发芽势和发芽率。以JTR为父母本的种子的发芽势具明显优势,以AGR为母本的种子的平均发芽势最低,以DTR为父本的种子的平均发芽势最低。T1代7天的平均芽长和根长分别为3.9cm和3.2cm。以JTR为父母本的种子,平均芽长最长,而以AGR为父母本种子,平均芽长最短。田间JTR的子代表现最优,以DCK和ATR-12为母本自由杂交的子代出苗势和出苗率均达100%。自由杂交授粉比人工授粉的种子具有更高的田间出苗势、出苗率、苗高和分蘖数,即使同一母本所得种子的萌发能力也不同。 7、hyg和PEG对爱神特种子的萌发具有极显著影响,75mg/L hyg将发芽势降至44.8%,但发芽率仍达61.5%,hyg不适合在萌发期筛选转基因子代。15%的PEG只能使极个别种子发芽,20%则完全不能发芽。以15%的PEG筛选转基因T1代种子,推测的外源基因分离规律均低于孟德尔遗传定律。 8、建立快速检测多年生黑麦草转基因植株hyg抗性的方法:1mg/L 6-BA+50mg/L hyg可用于多年生黑麦草离体叶片段的筛选,第8天时的褐化情况可作为初步筛选转基因植株的依据。盆栽T1代经干旱筛选后恢复生长的植株进行hyg叶片筛选,经筛选后的植株进行PCR检测全部呈阳性,初步说明外源基因在植物体内能够稳定遗传。 9、转DREB1A和转BADH-CMO基因多年生黑麦草属于安全等级为I级的转基因植物,已经国家林业局生物安全处批准进行中间试验。
【学位授予单位】:北京林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S543.6

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【引证文献】
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【参考文献】
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2 王冬梅;毛白杨花芽分化规律与开花调控的分子基础研究[D];北京林业大学;2007年
3 刘俊祥;多年生黑麦草对重金属镉的抗性机理研究[D];中国林业科学研究院;2012年
4 杨莉;金柑遗传转化体系的建立与应用[D];浙江大学;2006年
5 范爱丽;大白菜细胞质雄性不育基因orf224和orf138表达载体构建及遗传转化[D];西北农林科技大学;2009年
6 马雄风;苎麻抗虫基因遗传转化研究[D];中国农业科学院;2009年
7 冯霞;多年生黑麦草人工诱发变异的多态性分析与鉴定[D];中国林业科学研究院;2005年
8 马丽;玉米矮花叶病毒基因遗传转化研究[D];山东农业大学;2007年
9 李达旭;几种禾本科牧草遗传转化体系的建立和抗虫转基因研究[D];四川大学;2006年
10 赵军良;基因工程改良大白菜的抗虫抗病性研究[D];山西大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 谷会涛;磨盘柿离体再生体系的建立与遗传转化的初步探索[D];河北农业大学;2006年
2 陶凤杰;悬铃木再生体系建立与开花关键基因转化[D];北京林业大学;2007年
3 梁慧;菊花高频再生体系建立及根癌农杆菌介导遗传转化体系的优化[D];西南大学;2006年
4 黄丽云;非洲菊高效再生体系的建立与双抗虫基因转化的研究[D];华南热带农业大学;2006年
5 陈季琴;多年生黑麦草组培再生体系的研究[D];北京林业大学;2004年
6 梁华;多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导遗传转化因素的初步研究[D];西南大学;2009年
7 纪丽丽;杨树基因枪多基因共转化研究[D];中国林业科学研究院;2004年
8 杨茹;多年生黑麦草再生体系的建立及农杆菌介导AVP1基因的导入[D];甘肃农业大学;2008年
9 胡晓敏;农杆菌介导的高羊茅转化WAX2基因研究[D];湖南农业大学;2008年
10 房丹;南林895杨抗虫转基因研究[D];南京林业大学;2005年
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