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《北京林业大学》 2008年
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日本结缕草(Zoysia japonica Steud.)悬浮再生体系的建立与超低温保存研究

方文娟  
【摘要】: 以日本结缕草(Zoysia japonica Steud)品种‘Zenith’和来源于山东和辽宁的野生材料‘Liaoning’、‘Shandong’为试验材料,进行了悬浮体系建立、体胚诱导和遗传转化和超低温保存的研究,以期建立起高频再生体系,并对体系进行长期稳定的保存,为结缕草细胞工程和基因工程奠定了理论和实践基础。主要成果如下: 1.建立并优化日本结缕草悬浮体系。淡黄色、颗粒状、结构松散的胚性愈伤组织适合悬浮培养,悬浮培养基是液体MS2(MS+2 mg/L2,4-D)。初期,条件培养基与新鲜培养基比例以1:3为宜。同一克隆的愈伤组织,随着继代次数的增加,体系建立需要的时间变短。 2.显微观察发现,悬浮培养前期,散出细胞多为长条形具有明显的大液泡;随着时间的延长,椭圆形细胞逐渐增多,细胞内颗粒状的内含物逐渐增多;悬浮体系建立后,细胞为椭圆形,细胞质浓厚,无明显的大液泡,内含物丰富。 3.悬浮体系的生长曲线分为滞后期、对数生长期、静止期和衰亡期。接种密度以5~7 ml(PCV)/100 ml为宜,培养周期为7天。最适宜悬浮体系生长的pH值范围是5.5~6.2。 4.建立了日本日本结缕草体胚诱导、再生体系。液体MS培养基和固体MS培养基均能诱导体胚的产生。但液体诱导的体胚难以进一步分化。固体再生培养,两个月后获得再生植株。 以Zenith品种的胚性悬浮体系Clone A、Clone B和非胚性悬浮体系Clone J为试验材料进行了玻璃化法、快速冰冻法和干燥法超低温保存研究,建立了悬浮细胞保存体系。取得以下进展: 1.胚性悬浮细胞系冻存后细胞存活率大于非胚性细胞悬浮系;预培养可以显著的提高细胞存活率,预培养后适当的干燥处理也可以提高细胞存活率;过渡处理显著地降低细胞存活率;冻后细胞37~40℃水浴快速解冻后培养。 2.玻璃化法冻存同一克隆不同生长时期的细胞结果表明,不同时期的细胞冻后存活率差异显著。对数生长后期和静止前期的细胞存活率分别为56%和74%。对数生长早期和衰亡期的细胞存活率分别为12%和11%。而快速冰冻法保存过程中,不同生长时期无显著差异。 3.随着预培养时间的延长,悬浮细胞存活率呈抛物线形,在预培养7天时达到了最高值。玻璃化法保存过程中,单培养初期(1~5 d)以蔗糖预培养液最佳,7 d以后与山梨醇预培养液差异不大。总体而言,玻璃化法超低温保存用蔗糖预培养液优于山梨醇预培养液。快速冰冻法以0.8 mol/L山梨醇预培养的细胞体系为最佳。复合预培养中,先蔗糖后0.4 mol/L山梨醇预培养效果最佳。 4.用PVS2作冰冻保护剂的玻璃化法超低温保存,悬浮细胞在常温下脱水20min为最佳,冰浴条件下脱水40~60min最佳。冰浴可以提高细胞玻璃化法保存TTC活率。经过预培养的悬浮细胞,可以适当缩短脱水时间,以20~40min为宜。 5.不同的预培养方式和冷冻方法均对冻存后细胞的再生长影响很大。其中高渗处理可以在很大程度上提高体系冻存后再生率。恢复生长的细胞分为颗粒状、水渍状两种,随着培养时间的延长,部分水渍状愈伤组织逐渐死亡或转变为颗粒状愈伤组织。
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