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《北京林业大学》 2009年
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BADH基因、反义4CL基因对二色胡枝子的遗传转化研究

杨晓红  
【摘要】: 胡枝子(Lespedeza Michx.)是优良的水土保持和饲料型灌木,提高其抗逆性和饲用品质存农业、林业生产上具有重要意义。 许多转基因成果表明外源甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的导入可提高植物的抗旱、耐盐性。4-香豆酸-辅酶A-连接酶(4CL)是木质素合成过程中的关键酶,反义转入4CL基因可降低一些植物的木质素。木文选用BADH基因、反义4CL基因为目的基因,构建了以木糖异构酶(xylA)基因为标记基因的植物表达载体pBI121-xylA-BADH和无选择标记基因的双元植物表达载体反义4CL-BADH,期望通过转基因技术实现胡枝子木质素和抗逆性的遗传改良。试验材料选用生物量大,来自美国的二色胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)为研究对象,优化了二色胡枝子的再生体系,建立了二色胡枝子遗传转化中的木糖选择系统和无标记基因选择系统,并将xylA-BADH基因、反义4CL-BADH基因转入到二色胡枝子之中,获得了转基因植株,并检测了转基因植株的部分功能。该项研究对促进转基因胡枝子的生产应用和胡枝子饲料产业的发展具有理论和现实意义。 主要研究内容和结果如下: (1)从大肠杆菌基因组中克隆出了木糖异构酶基因xylA,构建了以木糖为选择剂的植物表达载体pBI121-xylA-BADH和无选择标记基因的双元植物表达载体反义4CL-BADH,并将这两个表达载体转化到根癌农杆菌中。 (2)在二色胡枝子再生体系建立和优化过程中,确定了二色胡枝子培养过程中的基本培养基为大量元素浓度减半的MS培养基,命名为MS*。确定了二色胡枝子子叶节分化最适配方为:MS*+6-BA 1-0 mg.L~(-1)+NAA 0.2 mg.L~(-1)+蔗糖3%+琼脂6 g.L~(-1),茎段增殖适合配方为:MS*+6-BA 1.0 mg.L~(-1)+NAA 0.1 mg.L~(-1)+IBA 0.2 mg.L~(-1)+蔗糖3%+琼脂6 g.L~(-1);生根最适配方为:MS*+NAA 0.1 mg.L~(-1)+IBA 0.2 mg.L~(-1)+蔗糖3%+琼脂6 g.L~(-1)。 (3)确定了二色胡枝子木糖选择系统和无标记基因选择系统的建立中头孢霉素的适用浓度,即:子叶节分化过程中为200~300 mg.L~(-1),茎段增殖和生根过程中为100 mg.L~(-1)。 当用木糖为选择剂进行pBI121-xylA-BADH遗传转化时,以3%的木糖取代蔗糖为子叶节不定芽分化过程中的选择剂,以0.5%的蔗糖和2.5%的木糖混合碳源作为抗性芽增殖和生根过程的选择剂。 在反义4CL-BADH对二色胡枝子进行遗传转化研究中,确定了在培养基中添加1g.L~(-1)的甜菜碱醛作为子叶节分化中的选择剂,培养基中添加0.3g.L~(-1)的甜菜碱醛和0.7g.L~(-1)的NaCl作为抗性芽增殖和生根过程的选择剂。 (4)经过PCR、PCR-Southern和Southern检测,获得了转入xylA-BADH基因的二色胡枝子和转入反义4CL-BADH基因的二色胡枝子。 耐盐性试验表明转入反义4CL单基因的二色胡枝子耐盐性最差,而转入xylA-BADH基因的二色胡枝子耐盐性最强,转入反义4CL-BADH双价基因的二色胡枝子耐盐性略次于非转基因材料。转入反义4CL-BADH基因的二色胡枝子组培苗经过1.0g.L~(-1)NaCl胁迫培养,其甜菜碱醛脱氢酶活性可达对照材料的2.5倍。 通过M(a|¨)ule反应、Weisner反应、卢索夫法组织化学染色和木质素荧光观察,初步表明反义4CL-BADH基因的导入有可能降低二色胡枝子的木质素含量,并对检测方法的可靠性进行了讨论。 此外,转入反义4CL-BADH的二色胡枝子茎段皮层组织中含有的异形细胞数量明显比对照多。通过对异形细胞、植物抗逆性、甜菜碱三者之间的关系讨论,认为转基因植株异形细胞数量多是由于BADH基因的导入可能合成了较多甜菜碱。
【学位授予单位】:北京林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S793.9

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