收藏本站
《北京协和医学院》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

化学修饰siRNA的设计、合成及其生物活性研究

李祎亮  
【摘要】:siRNA (Short interfering RNA, siRNA)干扰技术作为一种新型的基因沉默技术,因其具有高效、高特异性、低毒性等优点,应用siRNA干扰技术开发新型的靶向药物,已成为药物研究领域中重点发展方向之一。近年来,已经证实Argonaute蛋白(Ago蛋白)是RNA诱导基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)中关键的调控蛋白之一,在RNA干扰途径中,参与siRNA的识别、解链以及催化切割mRNA等功能,对靶基因沉默作用起关键调节作用。本论文是针对Ago蛋白与siRNA分子的协同作用机制,基于Ago蛋白的晶体结构,采用计算机辅助设计、荧光素酶活性筛选等研究方法,系统地研究化学修饰位点、修饰单体以及修饰组合与生物活性之间的关系,由此筛选出具有显著基因沉默作用的siRNA化学修饰组合,并且应用该修饰技术,利用前期研究已发现的高特异沉默作用的MDM2-siRNA序列,对化学修饰MDM2-siRNA进行了体外生物活性筛选。由此初步建立新型的siRNA化学修饰技术,并同时获得高特异性、高活性、高稳定性的化学修饰的MDM2-siRNA。 —FANA化学修饰位点与生物活性的研究 针对Ago蛋白与siRNA协同引起基因沉默作用的特点,选择特异性抑制病毒生长的5种不同靶基因siRNA序列,利用2’-脱氧-2’-氟-b-D-阿拉伯糖核苷酸(2'-Deoxy-2'-fluoro-b-D-arabino nucleic acid, FANA)修饰不改变RNA螺旋构型的技术优点,以该结构作为小分子探针,研究siRNA碱基序列不同化学修饰位点与生物活性之间的关系。生物活性检测结果显示: 1. siRNA正义链、反义链3’末端碱基FANA修饰,均能不同程度的降低靶基因沉默作用,其中反义链降低的作用更为显著。 2.反义链3’末端以及中间位点的碱基修饰,均容易导致化学修饰siRNA活性降低,尤其反义链中间9-11位碱基的修饰,生物活性作用降低更为显著。 3.正义链FANA修饰对基因沉默作用的影响相对较弱,正义链中间位点不同区域片段的碱基修饰,均能在不同程度上影响siRNA的活性,一般修饰后活性强弱顺序如下:D区C区B区,其中D区碱基修饰可能会在一定程度上提高基因沉默作用。 在本研究中,我们完成了FANA修饰单体的合成工艺探索,同时针对5种不同的靶序列,完成了44个新型化学修饰siRNA的制备,其中Ⅱ-siRNA6、Ⅱ-siRNA11以及Ⅴ-siRNA3对病毒的抑制作用显著,值得进一步评价。 二Ago蛋白PAZ区的理论研究 基于Ago蛋白PAZ区的晶体结构,设计了X、Y和Z共3种系列的新型化学修饰单体,利用计算机辅助药物设计的方法,预测了PAZ区与3’末端不同化学修饰组合相互之间的结合能,初步推测其与基因沉默作用之间的关系,实验结果显示: 1.选择1SI2和1SI3的晶体蛋白进行骨架叠合,二者叠合结果十分理想,PAZ区的结构相对比较保守;以1SI2作为模板,对siRNA与Ago蛋白的作用模式进行结构分析,数据表明siRNA的3’末端碱基可以与PAZ口袋区特异结合,适当引入疏水性基团,有利于两者之间的相互作用。 2.选择X、Z系列的修饰单体,利用MacroModel模块,预测和评价了3’末端不同化学修饰组合与Ago蛋白PAZ口袋区结合能量变化的趋势,结果显示,dTX修饰组合总结合能、范德华作用力结合能均最小。 3.利用计算机辅助设计中分子叠合的方法,初步预测和评价了3’末端不同的修饰组合与Ago蛋白PAZ口袋区结合后立体构型的变化状态,实验结果表明,相对于未修饰dTdT组合,dTX修饰组合立体构型基本保持不变,第2位疏水性基团替代嘧啶类结构,有助于芳香性疏水片段与PAZ区疏水性氨基酸残基,通过弱的范德华作用产生静电结合。 4.新型修饰单体的化学结构,活性结合位点取代基团的电负性,以及结合作用模式等,均影响总结合能的变化,引入疏水片段能显著降低总结合能;dTX修饰组合在空间结构上与dTdT组合基本保持一致,芳香性疏水片段替代碱基更有助于降低siRNA的3’末端与PAZ区的结合能;推测dTX修饰组合将极有可能起到增强基因沉默作用的效果。 三末端修饰siRNA的研究 设计并合成了X、Y和Z共3种系列的新型化学修饰单体。基于荧光素酶稳定表达的HepG2/PGL4细胞,选择X系列的修饰单体,采用双荧光素酶的筛选方法,对化学修饰的siRNA进行了体外生物活性的筛选,实验结果显示: 1.相对于未修饰siRNA,化学修饰siRNA在500 nM给药剂量下,未发现明显的细胞毒性,表现出比未修饰siRNA更低的细胞毒性。 2.dTX修饰的反义链与不同修饰的正义链交叉组合,制备获得新型化学修饰siRNAs,均能明显增强对靶基因的沉默作用。 3.3’末端siRNA的化学修饰,能显著改变siRNA的基因沉默作用,说明PAZ区与siRNA的特异识别,在基因沉默作用中可能起关键的调节作用,3’末端的碱基是siRNA关键的修饰位点。 4.通过生物活性的筛选,初步发现修饰组合为XdT/dTX、dTX/dTX(正义链/反义链),能显著增强siRNA的基因沉默作用。 四化学修饰MDM2-siRNA的研究 采用具有显著增强基因沉默作用的化学修饰组合,完成了不同化学修饰MDM2-siRNA的设计、合成以及生物活性、生物稳定性的研究,实验结果显示: 1.前期筛选获得的XdT/dTX、dTX/dTX、以及dTX/XX等化学修饰组合,能显著增强siRNA对肿瘤细胞MDM2的基因沉默作用。 2.不同化学修饰组合的siRNA与未修饰siRNA相比,能不同程度地提高siRNA的稳定性,其中dTX/dTX修饰组合稳定性优于其他修饰组合。 3.筛选获得的Ⅶ-siRNA6相对未修饰siRNA,能明显提高基因沉默作用、稳定性、以及体外抗肿瘤活性,其活性作用分别提高约为2、2和3倍左右,Ⅶ-siRNA6可以作为较好的候选化合物,进行更深入的筛选和评价研究。 以上实验结果表明:反义链C区、正义链B区的碱基与Ago蛋白协同作用,参与siRNA的解链和切割的过程,这些位点FANA修饰,容易阻碍Ago蛋白对siRNA的催化解链功能,从而显著降低修饰后siRNA的基因沉默作用;3’末端引入不同的化学修饰基团,能显著影响siRNA与Ago蛋白结合和解离的能力,反义链3’末端化学修饰单体或修饰组合的改变,对基因沉默作用的保留或提高起关键作用。 基于siRNA的3’末端与Ago蛋白特异结合的分子作用机制,通过Ago蛋白的理论研究和生物活性筛选的研究,初步证实理论计算的结合能与生物活性存在一定的联系,利用结合能、结合模式的评估,可以在总体趋势上较好的预测修饰组合与生物活性之间潜在的规律;此外,应用理论计算结果虚拟筛选获得的几种修饰组合,在不同靶序列的筛选上均能显著提高基因沉默作用,该修饰组合技术具有一定的通用性;dTX/dTX化学修饰组合,能显著提高MDM2-siRNA的基因沉默作用、体外生物稳定性、以及体外抗肿瘤活性,达到了我们课题的设计目标,同时也为新型化学修饰单体的设计、合成以及结构改造提供了有益的启示。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R914

手机知网App
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 凌萧鸣,public2.zz.ha.cn,郑英,张涛;子宫颈上皮内瘤样病变和子宫颈鳞癌组织中p53与MDM2的表达及其与PCNA的关系[J];癌症;2000年07期
2 赵剑华,刘芝华,尹大力,陈捷,骆爱萍,吴旻;基于p53- mdm2复合物结构的mdm2阻断剂的初步探讨[J];癌症;2001年04期
3 Nathan H. Lents;;以任何方法剪接:Mdm2位于肿瘤监视的十字路口[J];癌症;2008年09期
4 张鲁伟;周荣祥;;膀胱移行细胞癌组织ΔNp63和MDM2蛋白表达及意义[J];青岛大学医学院学报;2007年05期
5 赵海军;;肾细胞癌组织中△Np63和MDM2蛋白的表达及其临床意义[J];青岛大学医学院学报;2008年04期
6 邵月婷;刘亚男;邵晨;汲坤;李晓洁;李峰;张灵;赵丹;李扬;徐德启;胡嘉弟;赵雪俭;;共表达野生型p53及siRNA-mdm2质粒的构建及其在PC-3细胞中的表达[J];吉林大学学报(医学版);2010年01期
7 于莉娜;钟雪云;陈运贤;刘致中;秦艳芳;杜彬;;人胶质瘤细胞株SWO-38异质性蛋白质分子机制的研究[J];中国神经肿瘤杂志;2003年04期
8 于莉娜;钟雪云;华兴;袁显忠;方力;;人胶质瘤细胞株SWO-38 Mdm2与p53相关蛋白的异质性分析[J];广东医学;2006年09期
9 张鑫;康凯夫;;MDM2和PTEN表达与肝癌发生发展的相关性[J];广东医学;2010年09期
10 韩帮锋;李龙江;;Numb蛋白抑制肿瘤发生的研究进展[J];国际口腔医学杂志;2011年01期
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孙伟;凋亡相关基因及其交互作用与食管鳞癌生物学特性的临床研究[D];新疆医科大学;2010年
2 王海云;鼠双微体2(MDM2)在醛固酮诱导的系膜细胞增殖中的作用及机制研究[D];北京协和医学院;2009年
3 刘壮;癌基因MDM2和抑癌基因P53的表达与儿童非何杰金淋巴瘤关系的研究[D];广西医科大学;2002年
4 欧阳玲;外阴鳞状细胞癌遗传变异与HPV感染状态的研究[D];中国医科大学;2005年
5 王迷娟;(一)基于p53-mdm2复合物结构的mdm2小分子阻断剂的设计、合成和生物学活性评价 (二)过碘酸钠去硅醚保护基方法及机理的研究[D];中国协和医科大学;2003年
6 于赫;树舌多糖GF对小鼠HepA瘤细胞可溶性蛋白质组及核蛋白MDM-2表达的影响[D];黑龙江中医药大学;2006年
7 朱丹;食管癌遗传易感性及癌变分子基础的探索[D];中国协和医科大学;1994年
8 赵剑华;(一)基于p53-MDM2空间结构的非肽类小分子MDM2阻断剂的初步研究 (二)RA109基因的染色体定位、蛋白的活细胞定位及蛋白原核表达、纯化和鉴定[D];中国协和医科大学;2001年
9 王迷娟;1.基于p53-mdm2复合物结构的mdm2小分子阻断剂的设计、合成和生物学活性评价 2.过碘酸钠去硅醚保护基方法及机理的研究[D];中国协和医科大学;2003年
10 杨俊明;食管鳞癌组织P53基因改变的检测及wt-P53基因转染对食管鳞癌细胞射线敏感性影响的研究[D];第四军医大学;1996年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李玉琴;幽门螺杆菌、MDM2SNP309基因多态性的交互作用与胃癌易感性的相关研究[D];南京医科大学;2010年
2 周亮;MDM2和p21~(WAF1)在人脑胶质瘤中的表达及相关性分析[D];郑州大学;2010年
3 秦瑞;卵巢上皮性癌中MDM2和P21的表达及临床意义[D];吉林大学;2011年
4 陈培煌;PTEN和MDM2基因在膀胱移行细胞癌中的表达及相关性研究[D];福建医科大学;2011年
5 郝增方;胃粘膜锯齿状结构中MUC2、MUC5AC、Bmi-1、c-Myc、MDM2的表达及意义[D];河北医科大学;2011年
6 张瑞雪;FXYD3蛋白在子宫内膜癌中的表达及临床意义[D];河北医科大学;2011年
7 王璐瑶;P53、MDM2及PTEN蛋白在人口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌中的表达及相关性研究[D];郑州大学;2011年
8 王琳;p53和mdm2蛋白在单纯肠上皮化生、不典型肠上皮化生中的表达及与胃癌关系的病理研究[D];山东大学;2011年
9 杨伟品;肌醇六磷酸对肝癌HepG2细胞体外生长抑制作用研究[D];青岛大学;2011年
10 陈利友;宫颈癌HPV感染与p53、MDM2、p16、pRb的关系[D];浙江大学;2002年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 马鹏鹏,葛晔华,郭睿,马静,陈平,薛社普,韩代书;小分子干扰RNA(siRNA)表达载体沉默靶基因的研究[J];解剖学报;2004年06期
2 郭述良,罗永艾;RNA干扰及其在呼吸系统疾病研究中的应用[J];国外医学.内科学分册;2004年12期
3 范怡敏,耿飞,吴兴中;RNAi的机制及RNAi技术的应用[J];医学综述;2004年04期
4 王占黎,卢景芬,张亮仁,张礼和;RNA干扰与药物的研究进展[J];国外医学.药学分册;2004年04期
5 梁树辉,丁杰,黄大伟,潘阳林,林涛,党冬梅,时永全,吴开春;胃癌细胞AGS中KDR的表达对人脐静脉内皮细胞生物学行为的影响[J];现代肿瘤医学;2005年02期
6 倪勤;RNA干扰技术防治病毒性肝炎的研究[J];国外医学.流行病学.传染病学分册;2003年04期
7 李月敏,姜明红,钱其军,宋三泰;RNAi技术在病毒性疾病和肿瘤治疗中的应用前景[J];军事医学科学院院刊;2004年03期
8 李光明,谢青,史毅,李定国,金由辛;siRNA对HSC结缔组织生长因子的抑制作用[J];上海第二医科大学学报;2005年02期
9 李继霞,周克元,蔡康荣,梁统,唐旭东,张月飞;利用RNA干扰效应阻抑鼻咽癌细胞bcl-xL基因表达和诱导癌细胞凋亡的研究[J];中华耳鼻咽喉科杂志;2005年05期
10 燕春艳;RNA干扰技术研究进展[J];实用医药杂志;2003年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 季爱民;苏丹;车鸥;李文适;孙靓;张忠义;杨彬;;壳聚糖/siRNA纳米粒介导的功能性基因沉默研究(英文)[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
2 邓清华;刘国文;刘磊;王建国;朱晓岩;李小兵;王哲;;siRNA特异性抑制犊牛原代肝细胞SREBP-1c基因的表达[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(上册)[C];2011年
3 黄伟;吕明;金明姬;杨长青;高钟镐;;mPEG-PCL-g-PEI聚合物的合成及其siRNA递送性能[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
4 陈宇;郑海涛;杨力建;陈少华;沈琦;刘思初;李萡;李扬秋;;靶向抑制PPP2R5C基因的siRNA的筛选[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
5 刘政;邱广斌;;MYCT-1基因特异的siRNA对GES-1细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
6 陈卫华;王跃闽;;Cb1-b特异性siRNA载体的筛选验证[A];华东六省一市泌尿外科学术年会暨2011年浙江省泌尿外科、男科学学术年会论文汇编[C];2011年
7 陈卓;陈玥;田苗;黄野;彭宜红;杨振军;张礼和;;异核苷修饰的siRNA的合成与活性研究[A];2011年全国药物化学学术会议——药物的源头创新论文摘要集[C];2011年
8 马列;刘幸;徐少骏;高长有;沈家骢;;复合siRNA的皮肤再生材料及其瘢痕抑制性能研究[A];2011年全国高分子学术论文报告会论文摘要集[C];2011年
9 刘芳蕾;周勇;应可净;;肺癌PLK1基因多态性及siRNA干预的研究[A];2011年第三十三届浙江省呼吸系病学术年会暨呼吸疾病诊治新进展学习班论文汇编[C];2011年
10 季爱民;苏丹;车鸥;李文适;孙靓;张忠义;杨彬;;壳聚糖/siRNA纳米粒介导的功能性基因沉默研究(英文)[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 余志平;打开功能基因组学与未来治疗学的大门[N];中国医药报;2004年
2 庄北宁;防治非典,专家称找到基因“新药”[N];新华每日电讯;2005年
3 杨霞;防治SARS药研发获阶段性成果[N];中国医药报;2004年
4 聂翠蓉编译;RNAi:生物技术的蓝月亮[N];科技日报;2003年
5 曾崇君;奇尔根核酸业务试水MBO[N];医药经济报;2004年
6 余志平;siRNA治疗研究异彩纷呈(上)[N];中国医药报;2007年
7 本报特约撰稿人 陆志城;RNA干扰技术遭遇“缺陷危机”[N];医药经济报;2003年
8 记者 毛黎;美开发出癌症治疗新技术[N];科技日报;2009年
9 张荔子;乳腺癌基因特异性药物曙光初现[N];健康报;2004年
10 杨霞;广东SARS防治药物研究取得阶段成果[N];中国医药报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 胡平方;纤溶酶原激活物抑制剂-1 siRNA治疗实验性肝纤维化[D];第二军医大学;2010年
2 徐向上;Aptamer-protamine-siRNA复合物在肿瘤靶向治疗中的作用研究[D];华中科技大学;2010年
3 李祎亮;化学修饰siRNA的设计、合成及其生物活性研究[D];北京协和医学院;2010年
4 蔡磊;携带Survivin特异性siRNA的完全人源性肝癌单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白对肝癌凋亡的影响研究[D];第四军医大学;2010年
5 张伟;H5N1亚型高致病性禽流感病毒siRNA靶向制剂的研究[D];中国协和医科大学;2010年
6 郭炬;siRNA靶向沉默HPA基因对人膀胱癌BIU-87细胞的生物学及HPA相关基因的影响[D];华中科技大学;2011年
7 于磊;PTI-1基因siRNA干涉载体构建及对转染的前列腺癌细胞系的生长抑制作用研究[D];第四军医大学;2006年
8 韩璐;豆科植物蒺藜苜蓿发育相关基因[D];山东大学;2010年
9 王哲文;后发性白内障的发病机制研究[D];吉林大学;2006年
10 向飞宇;心衰的机制与干细胞治疗基础研究[D];复旦大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 贾丽洁;ICP27特异性siRNA抑制HSV-1病毒复制的实验研究[D];郑州大学;2010年
2 方首镕;siRNA干扰MDR1逆转舌癌耐药性表型的实验研究[D];广西医科大学;2011年
3 付振宇;siRNA沉默HIF-1α基因对人前列腺癌PC3细胞生物学性状的影响[D];苏州大学;2010年
4 韦德芳;利用pSOS-HUS系统筛选靶向乙肝病毒X基因的siRNA的研究[D];重庆医科大学;2010年
5 李杰;抑制PKM2的siRNA协同抑制CCND1的作用机制研究[D];安徽医科大学;2011年
6 王涵;应用siRNA技术下调Survivin抑制鼻咽癌细胞生长的研究[D];昆明医学院;2010年
7 汤容;siRNA抑制人卵巢癌SW626细胞CXCR4基因的研究[D];重庆医科大学;2010年
8 吕玉春;靶向EV71 VP1基因siRNA真核表达质粒的构建及筛选研究[D];重庆医科大学;2010年
9 刘玉含;siRNA沉默TRX2基因对食管鳞癌EC9706细胞增殖和TPX2表达的影响[D];郑州大学;2010年
10 袁丽华;siRNA沉默SUMO-1基因对肝癌细胞SMMC-7721 Bcl-2及c-myc表达的影响[D];南昌大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026