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《北京协和医学院》 2010年
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人源性生物人工肝的制备及临床前研究

房青  
【摘要】:急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是病毒性肝炎一种危重的临床综合征,传统支持治疗病死率高达80%。肝移植是有效的ALF治疗措施,但由于肝供体严重缺乏,许多患者在等待供体过程中死亡。生物人工肝支持系统(bioartificial liver support system, BALSS)是未来最有希望在体外提供全面肝功能支持,使患者顺利过渡到肝移植或肝再生的有效治疗方法。BALSS的关键生物材料是肝细胞。虽然新鲜分离的猪肝细胞和人肝细胞瘤细胞都曾经被用作BALSS的细胞材料,但由于存在过敏反应、病毒感染和诱发肿瘤等不安全因素,临床应用受到很大限制。我们应用SV40 Tag和端粒酶转染原代人肝细胞建立了永生化人肝细胞系(immortalized human hepatocytes, IHH)。前期研究表明,IHH表现高增殖活性,可在微载体上高密度培养,体内不具有成瘤性。体外分析表明:IHH具有正常肝细胞的主要功能,表达与肝脏代谢、解毒、合成相关的基因和蛋白。将IHH与肝衰竭血清孵育后,可使血清胆红素进行性地降低,尿素进行性升高,表明IHH具有对胆红素和血氨的解毒功能。 目的: 应用微载体大规模培养IHH,构建人源性生物人工肝(human-derived bioartificial liver, hBAL),通过对大量ALF血浆灌流解毒的体外实验和对小鼠ALF模型、恒河猴ALF模型治疗的体内实验,评价hBAL治疗ALF的有效性和安全性,为hBAL进入临床Ⅰ期试验提供依据。 方法: 应用微载体搅拌悬浮方法大规模高密度培养IHH。 采用腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立裸鼠ALF模型,将微载体培养IHH注射于裸鼠腹腔内进行腹膜透析治疗,并设未治疗组和空微载体治疗组,比较各组动物的肝功能损伤指标,肝组织病理和动物生存率。 将微载体培养IHH和树脂颗粒灌装特制容器构建IHH细胞反应器,连接蠕动泵,对400 mL ALF血浆灌流解毒6 h,IHH细胞反应器再生18 h后,再次进行6 h灌流解毒,解毒-再生循环6次,观察ALF血浆胆红素、尿素浓度变化,评价IHH细胞反应器的体外解毒功能。 用间隔48 h两次注射D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)的方法建立恒河猴ALF模型,IHH细胞反应器连接血液净化装置制备hBAL,采用连续10 h每5h更换新的IHH细胞反应器的连续治疗模式及治疗5 h,间隔19 h,重复3次的间隔治疗模式对两只ALF恒河猴分别进行了hBAL治疗,观察转氨酶、胆红素、血氨、尿素、胆汁酸、血糖、凝血酶原时间、凝血酶原活动度、纤维蛋白原等肝功能损伤指标的变化及ALF恒河猴生存情况和不良反应,评价hBAL对ALF的疗效和安全性。死亡恒河猴肝组织切片HE染色观察肝坏死情况。对IHH进行了染色体分析及SCID鼠成瘤实验以评价其安全性。 结果: 采用微载体技术可大规模培养IHH,培养体积可达500-600mL。 腹腔注射CCl4后24 h,所有小鼠的转氨酶升高达正常值10倍以上。未治疗组和空微载体治疗组动物48 h内全部死亡,肝组织检查发现肝细胞广泛坏死;而采用IHH-微载体治疗组48 h动物生存率为83.3%,持续14d后转为长期存活。存活的动物转氨酶降至正常水平,肝组织检查显示肝细胞坏死显著减少,免疫组织化学染色显示腹腔微载体上肝细胞仍存活,并表达人肝细胞特异蛋白α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)。 IHH细胞反应器对ALF血浆灌流解毒6h后,可使血浆总胆红素下降18%,解毒-再生循环6次后,可使血浆总胆红素下降41%;血浆尿素从解毒-再生循环第4次起升高,到第6次,总升高幅度为22%,而空微载体对照组ALF血浆相应指标无显著变化。 间隔48 h两次注射D-GalN可成功制备恒河猴ALF模型,恒河猴血清转氨酶升高44倍,胆红素升高5.4倍,血氨升高2.5倍,凝血酶原时间75秒,凝血酶原活动度10%,未经治疗的恒河猴反应迟钝,进食饮水减少,呕吐,尿少,最长生存时间不超过63 h。 造模后48 h开始连续10h的hBAL治疗可使恒河猴血液肝损伤指标改善:转氨酶下降70-80%;胆红素下降约70%;血氨未继续升高,而尿素水平增高;总胆汁酸(total bile acid, TBA)下降约75%。治疗终止后上述指标反弹,到造模后4天为反弹高峰。凝血功能未改善,恒河猴生存7.6天。肝组织病理学检查显示与未治疗ALF恒河猴比,肝坏死减轻,肝淤血减少。 造模后24 h开始间隔hBAL治疗3次,每次均使转氨酶下降约50%,治疗终止后,转氨酶反弹升高,但造模后4天的反弹高峰幅度较低,仅为连续治疗的39%;间隔hBAL治疗抑制了胆红素升高,造模后4天的反弹幅度为连续治疗的12%;间隔hBAL治疗后尿素水平显著升高,约为连续治疗的一倍,同时血氨无显著升高。间隔hBAL治疗还抑制了TBA的升高,改善了凝血功能,造模后7天,凝血功能恢复正常。经3次间隔hBAL治疗后,ALF恒河猴痊愈而长期存活。 hBAL治疗过程中设备运行稳定,各项参数正常。不良反应有低血压和低血钙,对症治疗后缓解。 染色体分析示IHH为二倍体,IHH移植SCID鼠皮下和肝脏内6个月未成瘤。 结论: 应用微载体培养IHH可成功制备可再生性人源性生物人工肝。体外实验中可使400mL ALF血浆胆红素降低,血浆尿素增高,具有解毒功能。体内实验中可使ALF小鼠和ALF恒河猴生存期延长,肝损伤指标改善,疗效显著,安全性好。对ALF恒河猴治疗的间隔治疗模式疗效优于连续治疗模式,在肝损伤较轻时及时给予BAL治疗疗效较好。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R575.3

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