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《北京协和医学院》 2008年
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人羊膜间充质干细胞向视网膜神经元样细胞诱导分化及其钠离子通道电生理特性的实验研究

李略  
【摘要】:目的: 1.分离、培养和鉴定人羊膜间充质干细胞,观察其生物学特性,探讨其应用于神经再生治疗的可行性。 2.通过体外诱导分化实验,探讨人羊膜间充质干细胞向视网膜细胞分化的可能性。 3.对人羊膜间充质干细胞体外诱导前后钠离子通道的电生理特性进行研究,探讨其在向视网膜神经元样细胞分化过程中细胞功能的变化情况。 方法: 1.经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖腹产胎盘6份。采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离,PBS冲洗后剪成碎片,加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液37℃消化10mmin,共4次,收集细胞,用DMEM/F12/10%FBS/10ng/mL EGF培养基进行培养和纯化。 2.倒置显微镜下观察细胞形态;记录生长曲线;用流式细胞仪鉴定传1-3代人羊膜间充质干细胞的表面标志CD45、CD90(Thy1)和CD49d;免疫荧光细胞化学法和流式细胞仪检测神经干/祖细胞标记蛋白Nestin、Vimentin和Musash-1的表达。 3.用2%DMSO/200μmol/L BHA/10ng/mL bFGF诱导第3代人羊膜间充质干细胞,用免疫荧光细胞化学法和流式细胞仪检测诱导前后神经谱系标记蛋白Nestin、MAP2、NSE、GFAP和光感受器细胞标记蛋白Rhodopsin的表达;实时荧光定量PCR检测诱导0、3和7天Nestin、Rhodopsin和SCN2A mRNA的表达;通过全细胞膜片钳技术记录诱导前后细胞表面钠离子电流。 结果: 1.人羊膜间充质干细胞为贴壁细胞,表现为成纤维细胞样,可在体外大量扩增并纯化;表型分析结果显示:CD90(Thyl)、CD49d阳性表达,CD45阴性表达;人羊膜间充质干细胞表达神经干/祖细胞的标记蛋白,流式细胞仪显示从传1代至4代,Nestin阳性和Vimentin阳性细胞百分数均在80-90%,而Musashi-1阳性细胞百分数则维持在95%以上。 2.诱导分化后,大部分细胞变成具有细长突起的神经元样形态;流式细胞仪检测显示:诱导7d后Nestin阳性细胞从81.3%下降至24.9%,而MAP2阳性细胞从15.7%上升至91.3%,Rhodopsin阳性细胞从10.3%上升至97.1%,NSE阳性细胞从20.9%上升至94.3%,GFAP阳性细胞从1.4%上升至18.0%,经统计学分析有显著性差异(P0.05);实时荧光定量PCR检测显示:诱导3天后,Nestin的mRNA迅速下降为原来的0.19倍,7天后下降为0.15倍;诱导3天后,Rhodopsin的mRNA上升为原来的1.62倍,7天后上升为2.06倍;诱导3天后,SCN2A的mRNA上升为原来的1.24倍,7天后上升为1.83倍;人羊膜间充质干细胞在诱导前未记录到瞬时钠内向电流(0/13),诱导后部分细胞受去极化刺激时记录到钠离子内向电流(4/12),细胞表面钠离子电流出现率的差异具有统计学意义(P=0.039)。 结论: 1.人羊膜间充质干细胞可成功在体外培养、扩增和纯化,生物学性状稳定,含有丰富的神经前体细胞,可以作为一种优良的神经再生医学领域中组织工程、细胞治疗和基因治疗的种子细胞来源。 2.人羊膜间充质干细胞能够在体外诱导分化为表达视网膜光感受器细胞的标记蛋白、具有可兴奋性的神经元样细胞。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R329

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