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《北京协和医学院》 2009年
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血小板促进肿瘤细胞转移的相关机制研究

张娜  
【摘要】:肿瘤转移是恶性肿瘤导致患者死亡和难以治疗的主要原因。血小板可以增加肿瘤细胞在血管内皮细胞的粘附,并促进肿瘤细胞在转移器官的植入和生长,而抗血小板药物可以抑制肿瘤细胞的转移,但血小板促进肿瘤细胞转移的相关分子机制还不完全明了。因此,研究血小板促进肿瘤细胞转移的相关分子机制对肿瘤的治疗具有重要的意义。 目的:研究血小板在肿瘤细胞转移中的作用,分析血小板促进肿瘤细胞-内皮细胞粘附和肿瘤细胞转移的相关分子机制。 方法:采用人肝窦内皮细胞系(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC)和五种易发生肝转移的肿瘤细胞系(结肠癌细胞系HCT116、乳腺癌细胞系MDA-MB-231、肺癌细胞系A549、骨肉瘤细胞系HOS和MG-63)作为研究的细胞模型。五种肿瘤细胞系分别经缺氧24小时复氧2小时培养活化后,与荧光染料BCECF标记的血小板共孵育,通过连续光谱荧光仪检测血小板与五种肿瘤细胞的粘附,并分别给予抗血小板粘附分子的抗体以分析血小板不同粘附分子在介导血小板与肿瘤细胞粘附中的作用。LSEC经缺氧24小时复氧2小时培养活化后,与荧光染料BCECF标记的血小板共孵育,通过连续光谱荧光仪检测血小板与LSEC的粘附,并给予抗血小板及内皮细胞粘附分子的抗体以分析不同粘附分子在介导血小板与LSEC粘附中的作用。比较存在或缺乏血小板的情况下,肿瘤细胞在LSEC的粘附,并通过不同抗粘附分子的抗体阻断作用以分析血小板促进肿瘤细胞-内皮细胞粘附的分子机制。通过染料转移、流式细胞术和免疫电子显微镜检测血小板与内皮细胞粘附后的细胞融合。通过激光共聚焦显微镜和胶体金免疫电子显微镜技术确定血小板促进肿瘤细胞-内皮细胞粘附的直接证据。为进一步验证体外实验的结果,我们从BALB/c裸鼠尾静脉分别注射肿瘤细胞或粘附有血小板的肿瘤细胞,两周后摘取动物肺组织比较肿瘤细胞在肺的转移灶,并通过病理切片检测肿瘤细胞的转移情况。另外,我们将肿瘤细胞单独或与血小板共同分别接种到BALB/c裸鼠皮下,两周后观察肿瘤细胞的成瘤情况和肿瘤大小,通过免疫组织化学染色比较两组肿瘤组织中的微血管密度。 结果:血小板与缺氧-复氧后的五种肿瘤细胞的粘附明显增加,与对照组的肿瘤细胞相比存在明显的统计学差异。不同的肿瘤细胞与血小板的粘附可以分别被不同的抗血小板粘附分子的抗体阻断,其中血小板与A549和HCT116两种肿瘤细胞的粘附被抗gpⅠb、gpⅡb和gpⅢa的抗体阻断,血小板与MG63细胞的粘附被抗gpIIb和CD36的抗体阻断,血小板与MDA-MB-231细胞的粘附被抗gpⅠb、gpⅡb、gpⅢa和CD31的抗体阻断,血小板与HOS细胞的粘附被抗gpⅠb和gpⅡb抗体阻断。血小板与缺氧-复氧后的LSEC粘附也明显升高,与对照组LSEC相比也存在明显的统计学差异,并且可以被抗粘附分子gpⅠb、gpⅡb、gpⅢa、P-selectin和CD31的抗体阻断。在存在血小板的情况下,肿瘤细胞与LSEC的粘附明显增加,并且肿瘤细胞的粘附数量与加入的血小板的数量呈正相关关系,不同抗血小板粘附分子的抗体可以选择性地阻断血小板介导的肿瘤细胞-LSEC粘附。染料转移实验发现,血小板与LSEC粘附后,血小板中的荧光染料可以转移到粘附的LSEC中;流式细胞术分析显示,血小板与LSEC粘附后,血小板表面的特有粘附分子gpⅡb转移到LSEC细胞表面;透射电子显微镜证实,血小板与缺氧-复氧的LSEC粘附并且部分胞膜发生融合。激光共聚焦显微镜观察到,肿瘤细胞粘附到有血小板粘附的LSEC表面。采用胶体金免疫电子显微镜技术,清楚地证明血小板位于肿瘤细胞和LSEC之间介导了肿瘤细胞与LSEC的粘附。动物实验显示,与血小板粘附的肿瘤细胞经尾静脉注射后,其肺表面肿瘤转移灶的数量明显高于无血小板的对照组,两组间存在明显的统计学差异;并且肺组织中肿瘤细胞克隆数也明显多于对照组。裸鼠皮下注射肿瘤细胞2周后,与血小板混合的肿瘤细胞生长明显加快,肿瘤体积明显大于无血小板的对照组。组织学检查显示,混合血小板的肿瘤组织中微血管密度显著高于无血小板的对照组。 结论:血小板表面存在与血管内皮细胞或肿瘤细胞粘附的分子,血小板粘附或融合到内皮细胞后可以通过这些粘附分子介导肿瘤细胞-内皮细胞的粘附和肿瘤细胞的转移,并通过诱导血管生成促进肿瘤细胞的生长。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R730.2

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