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《北京协和医学院》 2011年
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携带中国HIV-1流行株RT基因的新型SHIV构建及生物特性研究

姚南  
【摘要】:目前,HIV疫苗尚未研发成功,抗病毒药物治疗在艾滋病治疗中占主导地位。抗HIV药物以逆转录酶抑制剂为主,其特异性靶点为HIV的逆转录酶(RT)基因。科研人员已研发多种新一代逆转录酶抑制剂,其在细胞水平表现出较高抗病毒活性,其药效学评价和耐药机制研究迫切需要包含HIV药物靶点的SHIV恒河猴动物模型。RT-SHIV是在猴免疫缺陷病毒(SIV)主体框架中替换上人免疫缺陷病毒(HIV)rt基因构建出的新型嵌合病毒,其主要特点是包含药物靶点特异性的HIV rt基因。该模型的建立能为筛选逆转录酶抑制剂提供一个理想的体内评价环境,可以极大的推动艾滋病药物的药效学评价研究。在此基础上,观察HIV病毒rt基因在逆转录酶抑制剂作用下的变异情况,为以后耐药性RT-SHIV/动物模型研究提供信息。本课题主要分为两部分,一、使用B亚型RT-SHIV/TC感染中国恒河猴,了解动物感染情况,确定检测指标,建立RT-SHIV/TC中国恒河猴动物模型;二、构建携带有中国HIV-1流行株rt基因的新型SHIV病毒,进行感染性筛选和动物感染实验。 第一部分:建立RT-SHIV/TC中国恒河猴动物模型。具体通过病毒扩增、病毒滴定和药物筛选实验,探索性研究现有RT-SHIV/TC在不同细胞上感染情况,在此基础上,进行RT-SHIV/TC病毒猴体感染实验及体内传代研究,建立RT-SHIV/TC中国恒河猴感染模型,之后分别通过紧急预防和疾病慢性感染期给药两种方式对感染猴进行药物治疗,确定RT-SHIV/TC对逆转录酶抑制剂的敏感性。这些数据表明:PBMC来源病毒比CEMx174细胞来源病毒具有更强毒力;RT-SHIV/TC能有效感染中国恒河猴,且经猴体传代后具有更强的毒力;细胞和动物水平验证了RT-SHIV/TC对逆转录酶抑制剂的敏感性。该部分研究初步建立了RT-SHIV/TC恒河猴药物筛选动物模型。同时,还进行了RT-SHIV/TC粘膜感染中国恒河猴探索。 第二部分:携带有中国HIV-1流行株rt基因的新型SHIV的构建。本研究以SIVmac239为主要骨架,分别从HIV-1病毒液和HIV-1质粒中扩增出目的rt基因(从3'开始的1-1652核苷酸)替换插入SIVmac239的相应区域而构建出RT-SHIV。主要构建出五种不同类别的携带有中国HIV-1流行株rt基因的RT-SHIV病毒,将这些重组病毒质粒转染293T细胞,收集病毒上清,分别感染TZM-bl细胞系,对克隆的生物学活性进行细胞水平鉴定。结果发现RT-SHIV/AE具有细胞感染活性,且对CEMx174细胞系和恒河猴PBMC具有很好的感染性,通过Ghost细胞确定该病毒为CCR5嗜性病毒。动物实验说明,RT-SHIV/AE能有效感染中国恒河猴。该新型嵌合病毒的构建将为我国艾滋病药物评价提供针对性病毒。 本研究初步建立了RT-SHIV/TC恒河猴药物筛选动物模型,能用于现有抗病毒药物的筛选和比较医学研究。成功构建了细胞及动物水平具有感染活性的携带中国流行亚型HIV-1 rt基因片段的新型RT-SHIV病毒株,使用该病毒建立药物筛选动物模型,将为针对中国流行株设计的药物提供一个体内药物筛选平台,也为基于RT-SHIV/AE耐药性克隆株建立耐药性动物模型提供了基础。本研究对我国抗HIV-1药物的研究、评价具有重要意义。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R512.91

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