利用PDMS微孔阵列研究三维空间因素对脂肪干细胞体外培养增殖及形态的影响
【摘要】：微孔阵列(Microwell arrays)是利用微尺度技术(Microscale technologies)在不同材料(玻璃、硅、PDMS、PLGA等)表面进行微米级加工并生成大量微孔的技术,本实验拟应用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)为微孔支架材料制备微阵列细胞培养试验平台,对组织工程种子细胞——大鼠脂肪干细胞(Rat Adipose Stem Cells, RADSCs)在不同孔径微孔中细胞增殖情况及形态学改变进行研究,以期验证微孔阵列这一新兴实验平台在干细胞组织工程研究中的可行性。同时,初步明确大鼠脂肪干细胞在微孔阵列三维培养平台上的增殖及形态学特点,为此平台在干细胞及组织工程领域的应用打下基础。本实验采用聚二甲基硅氧烷(poly-dimethylsiloxane, PDMS)为微孔支架材料,在其表面加工生成40μm、60μm和80μm等不同孔径微阵列,并将RADSCs单细胞接种其上。利用光学显微镜、扫描电镜及激光扫描共聚焦显微镜等手段,分别对各组中细胞的贴附能力、增殖情况、形态改变进行观察及检测。
结果：1、硅晶圆模板经酸性双氧水清洗后,再倒模后形成的PDMS微阵列支架基本符合设计要求。2、ADSCs直接种植在未经预处理的支架上时细胞贴附能力明显下降,而经10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FB S)培养基完全浸泡预处理后,细胞在PDMS表面的帖附及存活能力提高。3、体外培养120h时,其他条件保持恒定,不同孔径(40μm、60μm、80μm)的微孔内细胞生长总数具有显著性差异。4、随培养时间的延长在40μm微孔内生长的ADSCs更倾向于铺满孔底,60μm和80μm微孔内生长的ADSCs更倾向于沿孔壁-孔底拐角延伸生长。5、ADSCs在平面及微孔内生长,伸展形成“伪足”样及“桥”样结构,其内部丝状肌动蛋白(F-actin)排列方向与此结构长轴平行。
结论：利用微加工技术可以制作具有精细、统一表面结构的微孔阵列。将大鼠脂肪干细胞(ADSCs)悬液以一定浓度种植于PDMS微孔阵列内,细胞可在微孔内呈单个生长。细胞于PDMS表面及微孔内爬附生长表现“伪足”样及“桥”样结构,其内部F-actin纤维排列方向与此结构长轴平行。不同孔径微孔对ADSCs增殖及形态均存在影响,其中40μm微孔较60μm和80μm微孔更适宜ADSCs生长。
【关键词】：微孔阵列 微尺度技术 聚二甲基硅氧烷 ADSCs 【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329
【目录】：
- 摘要3-4
- Abstract4-7
- 综述一 脂肪干细胞生物学特性及其在实验领域的应用7-15
- 1、脂肪千细胞研究背景7-8
- 2、月旨肪干细胞特点8-9
- 3、月旨肪干细胞的定向分化9-12
- 4、组织工程中脂肪千细胞的应用12-13
- 5、月旨肪干细胞研究存在的问题及展望13
- 6、结语13-15
- 综述二 光刻技术及微尺度技术在组织工程领域的应用15-21
- 1、光刻技术15
- 2、微尺度技术及微孔阵列实验平台15-20
- 3 PDMS微孔阵列加工中的注意事项20
- 4、结语20-21
- 前言21-26
- 1、研究背景21-23
- 2、研究动机23-24
- 3、研究目的24-25
- 4、研究方法25-26
- 实验一:大鼠脂肪干细胞的分离与培养26-30
- 1、材料与方法26-27
- 1.1 实验材料及试剂26
- 1.2 实验方法26-27
- 2、结果27-28
- 2.1 细胞形态27
- 2.2 细胞染色及检测结果27-28
- 3、讨论28-29
- 4、结论29-30
- 实验二 利用PDMS微孔阵列研究三维空间因素对脂肪干细胞增殖及形态的影响30-43
- 1、材料与方法30-36
- 1.1 实验材料及实验设备30-31
- 1.2 光刻掩膜加工及光刻流程31-32
- 1.3 PDMS微孔板的生成与加工32-34
- 1.4 扫描电镜观察前样本准备34-35
- 1.5 荧光染色35-36
- 2、结果36-38
- 2.1 光镜观察结果36-37
- 2.2 扫描电镜结果37
- 2.3 激光扫描共聚焦显微镜观察结果37-38
- 3、讨论38-42
- 3.1 微孔阵列技术应用于组织工程领域的必要性38-39
- 3.2 PDMS生物安全性39
- 3.3 硅晶圆清洗及预处理39-40
- 3.4 PDMS微孔板的加工、清洗及预处理40-41
- 3.5 大鼠ADSCs在PDMS表面及微孔内的生物学表现41-42
- 4、结论42-43
- 全文结论43-44
- 参考文献44-51
- 附录一 略图51-64
- 附录二 略表64-65
- 致谢65-67
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