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《北京协和医学院》 2011年
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热休克蛋白47在大鼠结膜滤过泡瘢痕化过程中的作用及其作用机制的研究

王伟伟  
【摘要】:背景 青光眼滤过术后滤过泡瘢痕化一直是眼科研究的热点和难点。虽然对其进行了大量的研究,但仅有丝裂霉素C (mitmycin C, MMC)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)应用于临床,然而由于这两种药物的严重并发症而使其临床应用受到限制。胶原蛋白的异常合成与沉积是纤维化疾病的病理基础,亦是瘢痕形成的重要原因。热休克蛋白47(heat shock protein, HSP47)是一种相对分子质量为47000的热休克蛋白,存在于胶原蛋白分泌细胞的内质网中,与前胶原特异性结合,参与前胶原的折叠、装配、修饰、转运等过程,被认为是胶原特异性分子伴侣,为胶原合成所必需。多种纤维化疾病模型和人类纤维化疾病的研究均证实,HSP47的表达上调与胶原合成增加以及纤维化的发生、发展密切相关。抑制HSP47的表达可以抑制胶原合成,减弱纤维化程度。因此我们假设HSP47有可能成为治疗纤维化疾病的有效靶点。 目的 探讨HSP47在大鼠滤过术后滤过泡瘢痕化过程中的作用及其作用机制,以及通过此途径可能减轻滤过泡瘢痕化的方法。 方法 1.建立滤过术后结膜滤过泡瘢痕化大鼠模型。 2.应用免疫组织化学染色方法,了解HSP47在大鼠滤过术后滤过泡中的表达情况。 3.应用天狼星红-苫味酸染色方法,了解Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原在大鼠滤过术后滤过泡中的表达情况。 4.应用实时荧光定量PCR和Western blot方法,分别检测HSP47、I型胶原和Ⅲ型胶原在大鼠滤过术后不同时间点滤过泡中基因转录水平和蛋白质水平表达变化的情况。 5.采用抗HSP47单克隆抗体结膜下注射的方法,检测抑制HSP47蛋白的表达情况,应用实时荧光定量PCR和Western blot方法,分别检测Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的变化。 结果 1.选用大鼠作为实验动物,于滤过术中切除全层角巩膜缘组织,成功建立了滤过术后结膜滤过泡瘢痕化动物模型。 2.HSP47在大鼠滤过术后滤过泡和正常结膜组织均有表达。表达染色的细胞绝大多数为梭型的成纤维细胞,少数为血管内皮细胞,定位于细胞浆。滤过术后1w,HSP47蛋白较正常结膜组织明显增多;滤过术后2w, HSP47蛋白较术后1w有所减少,但是仍然比正常结膜组织表达水平高。 3.应用天狼星红-苦味酸染色方法可以清晰地显示Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原在大鼠滤过术后滤过泡的表达情况。滤过术后1w,大鼠滤过泡胶原蛋白较正常结膜组织增多,以Ⅲ型胶原增加为主;滤过术后2w,大鼠滤过泡胶原蛋白较术后1w明显增加,以Ⅰ型胶原增加为主。 4.大鼠滤过术后滤过泡中HSP47和Ⅲ型胶原在mRNA水平与蛋白质水平的表达均在术后2d就有增加,术后5d、8d、11d时明显增加,与正常对照组相比均有显著的统计学差异(P0.05),术后8d均达到峰值,术后11d均下降,但仍高于术后5d的表达水平。在滤过术后2d、5d时,Ⅰ型胶原在mRNA水平与蛋白质水平的表达增加,术后8d、11d时明显增加,与正常对照组相比有显著的统计学差异(P0.05)。 5.抗HSP47单克隆抗体结膜下注射1ug后,在蛋白质水平抑制了HSP47的表达,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原在mRNA水平与蛋白质水平的表达均下降,与生理盐水组相比差异有显著的统计学意义(P0.05),与MMC组相比差异无统计学意义(P0.05)。 结论 1.HSP47在大鼠滤过术后滤过泡成纤维细胞和血管内皮细胞的表达较正常结膜组织明显增高。Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原在大鼠滤过术后滤过泡的表达较正常结膜组织明显增高。手术创伤可以促使HSP47、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白质的表达上调,表明HSP47、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原在大鼠滤过泡瘢痕化过程中可能会发挥重要作用。 2.抑制滤过术后滤过泡中HSP47的表达,可以减少Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原在滤过泡的沉积,从而减轻滤过泡的瘢痕化反应。表明HSP47在大鼠滤过泡瘢痕化过程中通过调控Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达而发挥作用。抗HSP47单克隆抗体有可能成为未来青光眼抗滤过泡瘢痕化的药物。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R779.6

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