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基于动物肿瘤模型的LC-MS/MS代谢组学及药物代谢组学方法研究

沈国庆  
【摘要】:本论文采用正、负离子检测相结合的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析手段,建立了基于RPLC-MS/MS和HILIC-MS/MS互补的代谢组学分析方法,并将差异代谢物动态行为分析整合到代谢组学研究中,开展了Walker 256肿瘤模型的代谢组学研究,以寻找与肿瘤发展密切相关的生物标志物。在此基础上开展了抗肿瘤药物10-羟基喜树碱(HCPT)的药物代谢组学研究,旨在同时获得在不同病理状态下药物的代谢产物及药物引起的内源性代谢物的变化。在Walker 256肿瘤模型的代谢组学研究中,共发现了47个呈规律性变化且与肿瘤发展过程紧密相关的可能生物标志物,并鉴定出15个标志物的结构,其中包括9个动态变化行为相似的中链脂酰肉碱类代谢物,其反映了Walker 256肿瘤大鼠体内长链脂肪酸β-氧化的下调。此外,在HCPT的药物代谢组学研究中,通过给予高、低剂量HCPT的正常大鼠与Walker256肿瘤大鼠尿液之间的系统比较分析,不仅寻找到HCPT原形及其葡萄糖醛酸结合物,并发现了14个与HCPT的毒性、药效作用相关的内源性代谢物,同时筛选出6个更可靠的肿瘤生物标志物和3个HCPT敏感性标志物。上述研究表明,本研究方法不仅有助于发现与肿瘤发展密切相关的生物标志物,而且为生物体的代谢异常和肿瘤进程提供重要的生物学信息;采用代谢组学方法研究药物体内代谢过程及药物引起的内源性小分子代谢物的变化,可以获取药物代谢产物,以及与药物毒性和药效作用相关的代谢物等多种信息。 本论文的研究内容主要包括以下四个部分: 1.基于LC-MS技术的大鼠尿液代谢组学分析方法研究 为了改善尿液中强极性代谢物的分析,本研究在“互补性”分析思路的指导下,将HILIC-MS与RPLC-MS方法相结合分别对尿液经固相萃取(SPE)后的水洗脱部位和甲醇洗脱部位进行了系统分析。以尿液中代表性小分子代谢物为分析对象,重点对方法的精密度、灵敏度和回收率进行了细致的考察,结果表明本方法精密度好,且对大部分被分析物灵敏度高,回收率良好,能够满足代谢组学中尿液样本分析的要求。因此,本研究采用正、负离子检测模式相结合的RPLC-MS/MS和HILIC-MS/MS手段,建立了适用于大鼠尿液样本的代谢组学分析方法。 2.基于Walker 256肿瘤模型的代谢组学研究 本研究采用建立的代谢组学分析方法,结合差异代谢物动态行为分析,开展了Walker 256肿瘤模型的代谢组学研究,以寻找与肿瘤密切相关的生物标志物。在肿瘤的代谢组学研究中,生物标志物的动态变化趋势应与肿瘤的发展过程密切相关,因此,本研究对差异代谢物在肿瘤发展过程中的动态变化行为进行了细致考察,其结果发现了变化趋势为含量先上升后下降或含量一直上升的差异代谢物,它们分别源于肿瘤的生长和荷瘤动物身体状态的变化,其反映了肿瘤的生长和发展进程,则可以确认为与肿瘤密切相关的重要生物标志物。本研究共获得了47个可能生物标志物并鉴定出15个标志物的结构,包括12个L-肉碱及其衍生物,2个氨基酸衍生物和1个核苷。生物学意义分析表明这些代谢物的异常可能预示着肿瘤大鼠体内发生的代谢紊乱,包括肿瘤细胞的快速复制,脂肪酸的β-氧化的下调和免疫力的下降等。目前,本研究已发现上述可能生物标志物在肿瘤发展过程中均呈现规律性的动态变化,则它们的含量变化可以实时监测Walker 256肿瘤的进程,有望为人类癌症进程的监测提供重要参考。 此外,本研究将代谢相关性网络分析应用于生物标志物的结构鉴定及其生物学意义分析中,并充分挖掘可能生物标志物之间的相关性。同时,结合代谢途径分析,考察推断了与疾病相关且发生紊乱的代谢途径,从而为肿瘤发生、发展机制提供重要依据。 3.基于Walker 256肿瘤模型的药物代谢组学方法研究 本研究在上述研究的基础上,采用代谢组学的研究思路,以给予HCPT的正常大鼠Walker256肿瘤模型大鼠尿液样本为研究对象,建立了药物代谢组学分析方法,开展了健康动物与肿瘤模型动物的药物体内代谢过程以及药物引起内源性代谢物变化的研究。通过对给予高、低剂量HCPT的正常大鼠与Walker 256肿瘤大鼠尿液样本的系统比较分析,结果寻找到HCPT原形及其葡萄糖醛酸结合物,并分析考察了因给药时间、剂量和病理状态不同引起的代谢变化情况。其次,分别从高、低剂量给药组和不给药组的共同差异代谢物中获得了14个与HCPT毒性、药效作用相关的内源性代谢物;此外,从已发现的可能生物标志物中筛选出6个更可靠的生物标志物和3个HCPT敏感性标志物。上述研究结果表明,采用本研究思路建立的药物代谢组学研究方法,不仅可获得药物体内代谢转化以及与药物毒性和药效作用相关的信息,而且能进一步筛选出更可靠的生物标志物及药物敏感性标志物。本研究方法有望为药物研究提供新的研究思路及途径。 4.代谢组学尿液分析的校正方法考察 在基于质谱技术的代谢组学研究中,选择一个理想的尿液校正方法很为必要,然而尿液校正效果缺少统一的评价标准,则难以评价尿液校正方法的优劣。本研究首先采用连续稀释的尿液样本,对常用尿液校正方法的校正效果进行了考察,力求状得最佳的校正方法;其次,以肿瘤接种前后的大鼠尿液样本为分析对象,对优选的校正方法进行了验证。结果表明,肌酐值控制进样量能较好地消除因代谢物含量不同引起的组内差异,获得较好的组内平行性和聚类效果;而峰面积归一化校正能进一步减小组内差异。因此,本研究提出对采用肌酐值控制进样量后的数据进行峰面积归一化校正可获得最佳的校正结果。


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