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《北京协和医学院》 2011年
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人卵巢癌干细胞的分离、鉴定及其特异性microRNA的筛选

骆黎静  
【摘要】:研究背景 肿瘤干细胞是肿瘤耐药和复发的根源。对卵巢癌干细胞的鉴定和分选将有助于解决卵巢癌耐药和复发问题。miRNA突变或异位表达与多种人类癌症有关,许多microRNA参与了干细胞的自我更新与分化。寻找卵巢癌干细胞特异性的microRNA将会为消灭卵巢癌干细胞提供一个绝佳的机会。本研究的目的是确定卵巢癌干细胞的候选标记物并对其特异性niRNA进行初步筛选。 研究方法 1.将14例人原代卵巢浆液性腺癌组织或腹水的肿瘤细胞接种于免疫缺陷小鼠的体内从而建立一种卵巢癌移植瘤模型。利用这种移植瘤模型来分析卵巢癌细胞中不同细胞群体的肿瘤形成能力。用流式细胞术来鉴定和分选移植瘤中CD117+Lineage-细胞并研究这群细胞的生物学特性。选取25例晚期卵巢浆液性腺癌患者的肿瘤组织标本进行CD117免疫组化染色,分析CD117的表达与化疗结局之间的关系。 2.用Hoechst 33342染色法检测了6个卵巢癌细胞系(HO-8910, OVCAR-3,3A0, ES-2, A2780和SK-OV-3)和3例卵巢癌裸鼠移植瘤中的侧群(SP)表型。运用流式细胞术分别从HO-8910, OVCAR-3,3A0以及1例移植瘤中分选SP和NSP(非侧群)细胞。我们对比了SP和NSP细胞体内外自我更新、分化和肿瘤形成的能力。运用real-time PCR方法检测了SP和NSP细胞中干性分子(Oct4, Klf4, Nanog)和ATP结合盒(ABC)转运蛋白(ABCG2, ABCB1, ABCC2)mRNA的表达。以药敏试验来检测SP和NSP细胞对紫杉醇、顺铂、米托蒽醌和多柔比星的敏感性。 3.利用基因芯片技术,将HO-8910 SP细胞microRNA与NSP细胞microRNA芯片杂交,找出差异表达的microRNA,通过特定基因反向筛选,找出调控干细胞自我更新和耐药的microRNA。 研究结果: 1.移植瘤中CD117+Lineage细胞的比例不足2%,在免疫缺陷小鼠体内只需要接种103个CD117+Lineage细胞即可成瘤,其成瘤能力是CD117-Lineage细胞的100倍。CD117+Lineage-细胞在裸鼠体内能够连续成瘤,其形成的肿瘤呈现出与其亲本肿瘤相似的细胞异质性,从而证明这群细胞具有干细胞的两大特性,即自我更新和分化。对临床样本CD117的免疫组化分析结果显示,CD117的表达率为40%(10/25例),CD117的表达与化疗耐药密切相关(P=0.027)。 2.在卵巢癌细胞系HO-8910, OVCAR-3、3AO以及3例移植瘤中能检测到不同比例的SP细胞,但在ES-2, A2780和SK-OV-3细胞系中不能检测到SP表型。与NSP细胞相比,SP细胞具有增强的自我更新、分化和肿瘤形成能力。干性基因(Oct4, Klf4, and Nanog)和ABC基因(ABCG2, ABCBl, and ABCC2)在SP细胞中表达上调,SP细胞对多种化疗药物耐受并能被顺铂富集。 3. HO-8910 SP和NSP细胞中共有26个差异表达的miroRNA,其中11个在SP细胞中表达上调,15个表达下调。下调的miroRNA中有11个可能参与调控SP细胞的自我更新和多药耐药功能。 结论: 1.CD117+卵巢癌细胞具有肿瘤干细胞的特性,包括自我更新、分化、高致瘤性和化疗耐药。针对CD117+卵巢癌细胞的治疗可能会是一种治疗卵巢癌的有效方法。 2. SP细胞能够富集肿瘤干细胞,SP是一种研究肿瘤的形成和耐药的有效技术。 3. SP与NSP细胞中存在差异表达的与自我更新和耐药相关的miroRNA。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R737.31

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