全基因组筛选胰腺癌耐药相关基因

【摘要】：目的：通过可四环素调控的全基因组随机突变的方法,筛选胰腺癌健择(GEM,Gemcitabine)耐药的关键基因和遗传通路,同时结合干细胞研究技术,深入了解胰腺癌化疗耐药的分子机制及其与肿瘤干细胞之间的可能联系,以确定新的联合治疗的靶点,为胰腺癌提供新的治疗策略。 方法：首先将含有四环素基因调控系统转录激活子(transactivator,tTA)的质粒通过脂质体稳定转染至人胰腺癌细胞系PANC一1和CAPAN一1细胞中,经荧光素酶报告基因检测建立可调控的Tet-off稳定表达细胞系,再构建含有tTA结合元件(tet Operater,tetO)的piggyBac质粒,通过电穿孔共转染的将piggyBac质粒和mPB质粒转入Tet-off稳定表达细胞系,通过G418药物筛选获得全基因组范围内的随机基因突变文库。在四环素存在或者不存在时,对GEM反应的差异具有统计学意义的细胞表型,通过自连克隆法或Splinkerete PCR法进行基因克隆及相关的功能验证；同时结合干细胞相关技术,通过piggyBac转座子系统将四个干细胞相关的转录因子转入Tet-off稳定表达细胞系中,诱导干细胞样细胞形成,观察其对GEM的药物反应的变化。 结果：建立了三个Tet-off稳定表达且可调控的胰腺癌细胞系,即PC68-PANC1,PC248-PANC1和2D2-CAPAN-1田胞系；成功构建了piggyBac基因搜寻载体TNO-PB,其Tet-off稳定表达细胞系中,建立全基因组随机基因突变文库；筛选对GEM的反应在Dox调控下有显著性差异的细胞克隆12个,进一步基因克隆得到初步的结果,并将克隆到的6个基因进行染色体定位和功能分析。同时通过piggyBac转座系统将携带四个干细胞相关的转录因子(Oct-3/4,Sox2,c-Myc和Klf4)和tetO的目的基因成功转染进入CAPAN-1-2D2细胞株,得到与ES和iPS细胞克隆形态相似的CAPAN-1-2D2/iPS样细胞克隆,对CAPAN-1-2D2/iPS样细胞克隆进行碱性磷酸酶显色和X-gal检测,结果呈阳性。 结论：PANC-1-PC68,PANC-1-PC248和CAPAN-1-2D2是人胰腺癌Tet-off稳定高表达的细胞系。以此为基础建立的随机基因敲除调控技术平台是进行胰腺癌化疗耐药相关基因筛选行之有效的方法,我们在现有基础之上将扩大突变文库的容量,增加胰腺癌化疗耐药相关基因的筛选范围,进一步进行候选基因的功能验证及克隆其它的GEM耐药相关基因；通过Oct-3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四个干细胞相关的转录因子的转入可诱导具有干细胞特性的人胰腺癌细胞形成,但尚需进行干细胞相关的表面标记和表达基因检测。总之,这些研究为进一步确定在胰腺癌化疗耐药及人胰腺癌的恶性生物学行为中其关键作用的先天及后天遗传学改变建立了一个新的研究平台。