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《北京协和医学院》 2009年
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Dkk3与Wif1对扩张型心肌病的调节机制研究

吕丹  
【摘要】:目的分析Dkk3与Wif1对cTnTR141W扩张型心肌病模型小鼠的调节作用。 方法逆转录PCR分别检测Dkk3与Wif1于野生型C57BL/6J小鼠中的时程表达变化,用组织原位杂交及免疫组织化学观察Dkk3于野生型C57BL/6J小鼠中的组织表达情况。cTnTR141w及cTnTR92Q基因表达芯片及逆转录PCR检测Dkk3与Wif1于扩张型心肌病及肥厚型心肌病模型小鼠中的表达变化。用逆转录PCR检测Dkk3与Wif1于阿霉素诱导的心肌损伤小鼠模型中的表达变化。分别将Dkk3基因及Wif1基因插入α-MHC启动子下游,分别构建转基因表达载体,通过显微注射法建立Dkk3转基因C57BL/6J小鼠及Wifl转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定cTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141W转基因小鼠的基因型,、Western blotting检测Dkk3及Wifl的表达,病理组织学染色和透射电镜观察cTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141W转基因小鼠心脏组织学及超微结构改变。M型超声心动图检测cTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141W转基因小鼠心脏的结构形态和功能变化。记录cTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141w转基因小鼠的生存状况。逆转录PCR检测cTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141W转基因小鼠心肌中包括肌小节蛋白基因、细胞骨架蛋白基因、钙调节相关蛋白基因及细胞外基质基因等反应心肌结构及功能相关基因的表达变化。Western blotting检测cTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141W转基因小鼠心肌胞质中β-catenin的表达。分别将cTnTR141W、Dkk3及Wif1基因插入CMV启动子下游,分别构建CMV-cTnTR141W、CMV-Dkk3及CMV-Wif1表达载体,脂质体法转染H9c2细胞建立过表达cTnTR141W、Dkk3、Dkk3×cTnTR141W、Wif1及Wif1×cTnTR141W的稳转细胞系,免疫荧光观察CMV-Dkk3及CMV-Wif1稳转细胞系中β-catenin的表达分布。 结果Dkk3及Wif1于野生型C57BL/6J小鼠中表达具有组织特异性,于心脏组织中皆有高表达。Dkk3于野生型C57BL/6J小鼠出生前后表达最高,Wif1于胚胎期表达最高,随着年龄增长二者表达迅速下调。cTnTR141W及cTnTR92Q基因表达芯片及逆转录PCR结果显示,Dkk3及Wif1皆于扩张型心肌病模型小鼠心肌中的表达有不同程度的上调,且Dkk3及Wif1在肥厚型及扩张型模型小鼠心肌中表达趋势相反,于阿霉素诱导的心肌损伤模型小鼠心肌中Dkk3表达上调。分别建立了2个系的心脏组织特异的Dkk3高表达转基因小鼠和Wifl高表达转基因小鼠,同时建立了心脏组织特异的Dkk3×cTnTR141w及Wif1×cTnTR141w两种杂交小鼠。M型超声心动图及心脏组织学显示,心脏组织特异表达Dkk3转基因小鼠心脏室壁增厚,心腔变小,心舒张功能稍有紊乱,电镜检测显示心肌细胞偶见肥大,排列发生轻微重塑,其余结构未见明显异常,其与轻度肥厚型心肌病病理改变相似,与cTnTRI41W小鼠相比,Dkk3×cTnTR141W杂交小鼠心脏室壁增厚,心腔缩小,心收缩功能明显改善,超微结构可见Dkk3×cTnTR141W杂交小鼠心肌纤维断裂溶解现象明显改善,线粒体肿胀程度明显减轻。反应心脏功能的肥大标志物Nppa及Nppb的表达变化与Dkk3小鼠表型变化一致,肌小节蛋白基因Myot及Cnn1皆于Dkk3小鼠中表达下调,而钙调节相关蛋白基因Atp2a2有增高趋势,反应心肌间质胶原成分的Collal及Col3a1及细胞骨架相关蛋白Acta1、Itga8和Itgb1bp3皆在Dkk3×cTnTR141w小鼠中的表达增加,显示心肌细胞排列及连接发生重构。Dkk3转基因小鼠心肌及CMV-Dkk3稳转细胞胞质中p-catenin的表达显著增加。心脏组织特异表达Wifl转基因小鼠心脏室壁变薄,心腔增大,心收缩功能出现紊乱,超微结构可见心肌纤维偶见变细,肌质网轻度扩张,其余结构未见明显异常,与轻度扩张型心肌病病理改变相似。与cTnTR141W小鼠相比,Wif1×cTnTR141w杂交小鼠心脏心腔进一步扩张,心收缩功能更差,超微结构可见Wif1×cTnTR141w杂交小鼠心肌纤维溶解、断裂现象更加明显,肌质网扩张并形成空泡,出现大量溶酶体。反应心脏功能的肥大标志物Nppa及Nppb的表达变化与Wif1小鼠表型变化一致,Wifl可显著降低细胞外基质基因Collal和Co13a1及细胞骨架蛋白基因Acta1及Itgb1bp3,并显著逆转了Colla1、Col3a1及Acta1于cTnTR141w小鼠中的上调,Wif1可显著降低钙调节相关蛋白基因Sln,对钙离子的转运有明显的影响,Wif1可显著降低肌小节蛋白基因Myot及Cnn1,并显著逆转了Myot于cTnTR141W小鼠中的增高。Wif1转基因小鼠心肌及CMV-Wif1稳转细胞胞质中(3-catenin的表达下调。4月龄cTnTR141W转基因小鼠出现早期死亡,至10月龄早期死亡率达15%,Wif1×cTnTR141W小鼠死亡率高达20%,而Dkk3、Wif1及Dkk3×cTnTR141W小鼠与cTnTR141W转基因小鼠相比较,死亡率相对较低。 结论Dkk3转基因小鼠心脏功能形态的改变与轻度肥厚型心肌病病理改变相似,同时Dkk3可明显改善cTnTR141W小鼠扩张型心肌病病理表型;Wif1转基因小鼠心脏功能形态的改变与扩张型心肌病病理改变相似,同时Wif1可进一步加重cTnTR141W小鼠扩张型心肌病病理表型。Dkk3与Wifl对cTnTR141W小鼠扩张型心肌病病理表型的调节差异可能是由对β-catenin的调节差异引起的。DkK3及Wifl很可能是心肌病调节的重要修饰基因,其可能作为心肌病治疗的新靶点,为临床心肌病的治疗提供新的研究思路和方向。 目的建立系统性表达Dkk3转基因模型小鼠,为研究Dkk3生理功能及对骨生长发育的作用提供工具动物。 方法通过ISH来观察Dkk3于C57BL/6J小鼠全身组织中的表达。把Dkk3基因插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6JDkk3转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测Dkk3在骨髓中的表达,Western Blot检测Dkk3在肺脏、脑及肝脏中的表达,BrdU标记染色观察转基因小鼠骨生长情况。 结果在生理状态下,Dkk3基因广泛表达,在骨、心脏及脑等组织高表达。建立的2个转基因小鼠品系中,转入的Dkk3基因在骨髓、脑、肝脏及肺组织中均有明显表达。BrdU整合率实验显示转基因小鼠长骨骺区细胞增殖明显低于同龄对照小鼠。 结论建立了系统性表达Dkk3转基因小鼠,转入的Dkk3基因明显抑制小鼠长骨骨骺区细胞增殖,为Dkk3对骨生长发育的作用研究提供了有价值的工具动物。 目的建立心脏特异表LMNAE82K转基因小鼠,为研究心肌病发病机制的关提供工具动物。 方法把LMNAE82K基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,显注射法建立C57BL/6J LMNAE82K转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠的基因型,采用Western Blot鉴定LMNAE82K在心脏组织中的表达,HE染色和超声检测转基因小鼠心脏的病理改变。 结果建立2个心脏组织表达LMNAE82K转基因小鼠品系。超声检查显示心壁变薄,收缩期容积和舒张期容积增加,射血分数,短轴缩短率降低。 结论LMNAE82K转基因小鼠具有与LMNAE82K引起的家族型扩心病类似的病理变化,为LMNAE82K与心肌病发病机制的关系及相关修饰基因的研究提供了有价值的疾病动物模型。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R542.2

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