收藏本站
《北京协和医学院》 2012年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

应用定量蛋白质组学方法研究代谢综合征早期肾损害尿液蛋白标志物

刘雪姣  
【摘要】:目的:探讨丙酮沉淀法提取尿蛋白的影响因素,优化丙酮沉淀法富集尿蛋白实验流程。 方法:(1)收集健康成年男性和女性各6例晨起第一次尿液50mL,将男性和女性的尿液标本分别混合,-80℃下保存备用。(2)实验分组:①根据是否加入防腐剂异噻唑啉酮分为两组;②根据尿液解冻方法不同分为两组;③根据尿液与丙酮的体积比不同分为两组,④根据尿液中加入丙酮后放置时间的不同分为五组。(3)主要步骤:解冻尿液标本,加入丙酮静置,4℃下离心,提取蛋白。Bradford法测量尿蛋白浓度,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)较各组间蛋白有无差异。 结果:1、防腐剂对丙酮沉淀提取尿蛋白没有明显影响;2、冰冻尿液在37℃下解冻和在常温下解冻对丙酮沉淀提取的尿蛋白成分没有影响;3、尿液与丙酮体积比为1:3时提取的尿蛋白浓度高于1:1时提取的尿蛋白的浓度(P0.05);4、随着放置时间的延长,提取的尿蛋白浓度依次增加。 结论:我们优化了丙酮沉淀富集尿蛋白的实验流程,及尿液中是否加入防腐剂对丙酮沉淀没有显著影响,可在37℃下溶解尿液样品,按尿液和丙酮体积比1:3加入丙酮,4℃静置过夜。 目的:在尿液蛋白质组学研究中,建立一种应用硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)膜快速富集和储存大量尿蛋白的样品处理方法。 方法:(1)收集健康男性和女性志愿者各2人晨起第一次尿液250mL,取等量尿液混合,平均分为20mL每管,—80℃冻存待用。(2)取20mL尿液,按尿液与丙酮体积比1:3在4℃下沉淀过夜富集尿蛋白,重复3次。(3)取20mL尿液,冰浴中将尿液按20mL/min循环通过NC膜1分钟(尿液一次通过NC膜的时间)、10分钟、30分钟、1小时、2小时和15小时,每个时间段重复3次。(4)取尿液20mL,按步骤(3)方法通过NC膜0分钟,将吸附有蛋白的NC膜置一80℃冻存6个月,重复3次。(5) Bradford法测量尿蛋白浓度,应用t检验的方法比较丙酮沉淀富集和NC膜各时间段吸附的尿蛋白含量。(6)应用SDS—PAGE初步比较丙酮沉淀富集和NC膜吸附的尿蛋白。(7)应用液相色谱分离串联质谱(LC-MS/MS)鉴定丙酮沉淀富集、NC膜吸附和冻存的尿蛋白。 结果:1、NC膜能够快速吸附尿蛋白,lmin-2h时蛋白量无显著差异(P0.05),15小时时吸附的尿蛋白量最多(P0.05)。丙酮沉淀法富集的蛋白量较NC膜吸附lmin-2h多(P0.05),较NC膜吸附15小时无显著差异(P=0.953)。2、SDS-PAGE结果显示,与丙酮沉淀法相比,NC膜吸附法包含了丙酮沉淀的主要蛋白条带,但明显减少了白蛋白的富集。3、LC-MS/MS鉴定结果显示,丙酮沉淀法、NC膜吸附0分钟和NC膜吸附15小时三组分别鉴定到628、619和323个蛋白,三组质谱鉴定的重复率分别为82.7%、76.7%和60.5%。4、丙酮沉淀富集和NC膜吸附的尿蛋白分子量和蛋白等电点没有明显的差异。9、尿蛋白在NC膜上冰冻6个月后,共鉴定到蛋白656个,质谱鉴定的重复率为80.2%,与丙酮沉淀和NC膜吸附的新鲜尿蛋白数目相似。 结论:1、通过与丙酮沉淀法比较,我们建立了一种简便快捷的尿液蛋白吸附方法:NC膜吸附法;2、NC膜吸附法适用于处理大规模的临床尿液样品;3、NC膜吸附法可以用来储存大量尿液标本中的蛋白。 目的:随着蛋白质组学技术不断发展,我们可以通过尿液蛋白质组学研究来寻找疾病的尿液蛋白标志物。由于人类的尿液蛋白质组存在很大的动态变化,本研究通过分析正常人尿液蛋白质组来确定尿液蛋白质组学研究时所需最小样本量,这在临床蛋白质组学研究中具有重要意义。 方法:(1)样品收集:收集20名健康志愿者(10男,10女)过夜尿;(2)丙酮沉淀法富集尿液蛋白后,进行胰酶酶切;(3)应用1DL-MS/MS方法鉴定蛋白:为了全面鉴定尿液蛋白质组,对每个蛋白样品进行多次重复的1DL-MS/MS鉴定。(4)通过统计学分析,确定尿液蛋白质组学研究所需最小样本量。 结果:(1)在男性和女性组中,当样本量超过9时,每增加一个样品,新增蛋白或肽段的数目5%。(2)在男性和女性样品混合组中,当样本量超过9时,每增加一个样品,新增蛋白或肽段的数目5%。(3)统计学分析发现,男性和女性尿液蛋白质组表达谱有一定的差异。 结论:为了全面鉴定人类尿液蛋白质组表达谱,最小样本量可以为6例;为了达到更好的蛋白鉴定效果,样本量可以为10例;一组样本中,男性和女性样本量最好平衡。 目的:评估相对和绝对定量的等量异位标签技术(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ)技术的定量效果;应用LC-MS/MS方法建立代谢综合征(metabolic syndrome, MetS)早期肾损害尿液蛋白质组表达谱;采用谱图数定量和iTRAQ标记定量两种方法鉴定MetS早期肾损害尿液差异蛋白;应用Western Blot方法验证候选蛋白标志物。 方法:(1)iTRAQ定量方法的评估:应用iTRAQ标记试剂114、115、116和117标记已知分子量的标准肽段混合物(tryptic peptide test mix4, TP4);由114-117标记后样品分别按1:1:1:1和1:2:4:6混合;应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)检测114、115、116和117之间的比例。(2)病例分组:将入选者分为健康对照(组Ⅰ:6例)、MetS合并正常白蛋白尿(组Ⅱ:6例)和MetS合并微量白蛋白尿(组Ⅲ:6例)三组。(3)尿液收集和处理:收集组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ患者的过夜尿;丙酮沉淀法富集尿液蛋白;将每组6例尿蛋白进行组内混合,后进行蛋白酶切及肽段除盐。(4)iTRAQ标记:取等量组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ酶切后肽段进行混合作为内标;iTRAQ标记试剂114、115、116和117分别标记内标、组Ⅰ组Ⅱ和组Ⅲ样品;标记后进行1:1:1:1混合。(5)质谱鉴定:应用LC-MS/MS分别鉴定组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ及iTRAQ标记后的混合蛋白样品。(6)蛋白相对定量及差异蛋白确定:采用谱图数定量法和iTRAQ标记定量法相对定量组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ中的蛋白;采用ANOVA检验比较三组间差异蛋白,应用Tukey检验进一步分析两两间差异蛋白。(7)蛋白功能分析:应用Panther软件分析两种定量方法共同鉴定到的差异蛋白的分子功能、参与的生物过程和分子通路。(8)蛋白验证:应用Western Blot方法在正常人、MetS合并正常白蛋白尿和MetS合并微量白蛋白尿患者的尿液标本中验证CP、APOA4和EGF蛋白的表达。 结果:(1)在MALDI-TOF/TOF质谱扫描中被检测到的标准多肽峰869、1262和1353均被iTRAQ试剂标记;标记试剂114-1]7标记的样品按1:1:1:1和1:2:4:6混合后,经MALDI-TOF/TOF扫描,114、115、116和117之间的比例基本符合上述比例。(2)非标记的组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ蛋白样品,分别鉴定到807、630和456个蛋白;iTRAQ标记后的混合蛋白样品共鉴定到566个蛋白。(3)通过谱图数定量,发现三组间差异蛋白共有156个,其中组Ⅰ与组Ⅱ间差异蛋白有88个,组Ⅱ和组Ⅲ间差异蛋白有64个:通过iTRAQ标记定量,发现三组间差异蛋白共有209个,其中组Ⅰ与组Ⅱ间差异蛋白有156个,组Ⅱ和组Ⅲ间差异蛋白有118个;两种定量方法,共同发现的三组间差异蛋白有73个,其中组Ⅰ与组Ⅱ间差异蛋白有37个,组Ⅱ与组Ⅲ间差异蛋白有21个。(4)蛋白功能分析结果显示,三组间差异蛋白的分子功能主要为结合功能、催化活性和酶调节活性;差异蛋白参与的生物过程主要为代谢过程、细胞过程和免疫过程;差异蛋白参与的分子通路最主要的为凝血通路。(5)Western Blot验证结果显示,CP和APOA4在组Ⅲ中的表达显著高于组Ⅰ和组Ⅱ;EGF在组Ⅱ和组Ⅲ中的表达显著低于组Ⅰ,与质谱鉴定结果相符。 结论:(1)我们应用LC-MS/MS鉴定,建立了正常人、MetS合并正常白蛋白尿和MetS合并微量白蛋白尿患者的尿液蛋白质组表达谱。(2)采用谱图数定量和iTRAQ标记两种定量两种方法鉴定到了三组之间的尿液差异蛋白。(3)通过验证,CP和APOA4可以作为MetS早期肾损害的候选蛋白标志物;EGF可作为MetS的候选蛋白标志物。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R692;R589

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 陶世冰;任艳;冉兴无;陈涛;高赟;喻红玲;张翔迅;高喜莲;钟莉;田浩明;;2007年成都地区成人代谢综合征患病率的流行病学调查[J];四川大学学报(医学版);2009年06期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前8条
1 马虹;龚媛;刘圆圆;宋洁;田浩明;陈涛;冉兴无;喻红玲;张祥迅;任艳;;成都地区2型糖尿病患者一级亲属糖尿病及糖尿病前期患病率的流行病学调查[J];四川大学学报(医学版);2011年02期
2 费扬帆;王椿;刘关键;高赟;陈涛;田浩明;冉兴无;;不同代谢综合征诊断标准运用于四川地区人群的比较分析[J];四川大学学报(医学版);2012年04期
3 曹菊秀;王红卫;李瑾虹;朱清云;李伟;;体检人群代谢综合征患病情况及危险因素调查与分析[J];护理管理杂志;2012年06期
4 杨玲;王海林;陶芳标;;某医科大学教职工高尿酸血症与代谢综合征相关性分析[J];中国学校卫生;2011年11期
5 佟晓霞;郭红霞;于兆莉;薛松梅;;市直干部代谢综合征及其相关疾病流行病调查[J];新乡医学院学报;2011年04期
6 管玉凤;;北京郊区8890名居民健康状况调查分析[J];中国当代医药;2010年26期
7 陈冬梅;彭谨;李春花;刘颖;谢梅青;;绝经与中国南方地区女性代谢综合征的关系[J];中国骨质疏松杂志;2011年11期
8 张凤梅;徐恒戬;;某高校教职工心血管病危险因素聚集情况分析[J];中国卫生统计;2012年06期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 ;第二部分 心血管病危险因素[A];中国心血管病报告2010[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 王莉;四川地区慢性肾脏病发病情况及危险因素分析[D];郑州大学;2010年
2 高碧霞;代谢综合征早期肾损害尿液多肽生物标志物的研究[D];北京协和医学院;2011年
3 蒋升;新疆维吾尔族、哈萨克族和汉族代谢综合征的差异性及三种诊断标准适用性对比研究[D];新疆医科大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 苏言辉;泸州市社区代谢综合征及其相关因素流行病学调查[D];泸州医学院;2011年
2 孙馨;男性警察代谢综合征因子分析及影响因素的研究[D];天津医科大学;2011年
3 安巧玲;大港油田在职职工代谢综合征特点分析[D];天津医科大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 胡泊;李卫;李印东;姜维平;李东;李骏;田秀珍;;北京和南京代谢综合征流行情况比较[J];疾病控制杂志;2008年02期
2 廖志红;余秋琼;邵虹;郞江明;栾晓军;翁建平;;广东佛山地区代谢综合征患病率现况调查[J];中国糖尿病杂志;2006年01期
3 陈蕾,贾伟平,陆俊茜,包玉倩,吴元民,姜素英,项坤三;上海市成人代谢综合征流行调查[J];中华心血管病杂志;2003年12期
4 脑卒中、冠心病发病危险因素进一步研究协作组,吴桂贤;11省市队列人群代谢综合征的流行病学研究[J];中华预防医学杂志;2002年05期
5 王海英;杨其法;张群勇;唐爱奇;陈燕;;杭州市余杭区成人代谢综合征的流行病学特征及其影响因素分析[J];中国慢性病预防与控制;2007年06期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 蔡秋凤;张凌晶;孙乐常;张农;苏文金;曹敏杰;;毒性与无毒性织纹螺肌肉蛋白的差异分析[J];集美大学学报(自然科学版)(网络预览本);2010年04期
2 冯同富;王琪;张玮;黎丹戎;李力;;耐卡铂人卵巢癌细胞相关蛋白的筛选研究[J];药物不良反应杂志;2010年06期
3 李水军;刘罡一;贾晶莹;余琛;周仁龙;杭燕南;;LC-MS/MS法测定全血中瑞芬太尼含量[J];药物分析杂志;2006年07期
4 刘萍;丁旭峰;章怡祎;乔健;;双向电泳—质谱法探索实验性重症肌无力大鼠疾病相关蛋白[J];中华中医药学刊;2007年12期
5 单秀明;杨钊;吴爱英;王友兰;;LC-MS/MS法测定宁心宝胶囊中腺苷的含量[J];中成药;2008年08期
6 杨留才;刘洪;宋曙;;双向电泳质谱法研究女性肺腺癌转移淋巴结的蛋白表达[J];南京医科大学学报(自然科学版);2009年06期
7 杨路平;王国玲;焦燕妮;;LC-MS/MS法测定人血浆中醋酸甲羟孕酮的浓度[J];中国现代药物应用;2010年08期
8 王文强;陈彬彬;吴海龙;章家新;谢加奖;;LC-MS/MS测定人血浆中哌甲酯[J];中国现代应用药学;2010年10期
9 郭婷婷;郑恒;钱振宇;毋丹;陈小梅;李冬艳;彭可垄;周莉萍;齐英涛;崔美兰;;血浆中硫普罗宁的测定及其片剂的人体生物等效性[J];中国医院药学杂志;2010年19期
10 顾利强;辛艳飞;张升;温磊;由振强;宣尧仙;;液质联用法测定比格犬血浆中依达拉奉的含量[J];浙江省医学科学院学报;2010年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王珊;高志红;章镇;徐军霞;侯计华;;果梅完全花与不完全花的差异蛋白分析(摘要)[A];第二届全国果树分子生物学学术研讨会论文集[C];2009年
2 王志华;李鑫;;应用SELDI蛋白质芯片技术对高低转移肺腺癌细胞差异蛋白的初步筛查[A];第九届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2006年
3 林祥明;林建峰;贺量;张茜;傅婉辉;陈清西;石艳;;菜青虫不同生长期相关蛋白的蛋白质组学研究[A];中国生物化学与分子生物学会农业生物化学与分子生物学分会第八次学术研讨会论文集[C];2008年
4 吴正正;严京;;蛋白质组学方法分析STZ诱导Ⅱ型糖尿病大鼠模型后视网膜差异蛋白变化[A];中华中医药学会第五次眼科学术交流会论文汇编[C];2006年
5 罗莹;杨云生;郭旭;彭丽华;王巍峰;孙刚;;便秘型肠易激综合征结肠黏膜组织差异表达蛋白质的筛选与鉴定[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(上册)[C];2007年
6 吴正正;严京;;蛋白质组学方法分析STZ诱导Ⅱ型糖尿病大鼠模型后视网膜差异蛋白变化[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年
7 李岩;康晓楠;郭坤;李雪飞;刘银坤;;小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞的蛋白质组学分析[A];第十二届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2009年
8 王志华;李鑫;;应用SELDI蛋白质芯片技术对高低转移肺腺癌细胞差异蛋白的初步筛查[A];2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2006年
9 聂作明;龙晓辉;贺平安;王丹;陈健;吕正兵;徐杰;陈芳;吴祥甫;张耀洲;;蚕孤雌生殖相关蛋白Elongation factor和HSP23.8的质谱鉴定、基因克隆与分析[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年
10 张文平;吕正兵;聂作明;龙晓辉;夏佳音;陈健;徐杰;盛清;王丹;吴祥甫;张耀洲;;家蚕有性生殖和孤雌生殖差异蛋白磷脂酰肌醇蛋白聚糖基因的克隆和序列分析[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 吴一福;军事医学科学院从MSCs中筛选出重要差异蛋白[N];中国医药报;2006年
2 记者 王雄伟;丙酮市场稳中走高局部货紧[N];中国化工报;2010年
3 陈银健 张欣;江苏口岸丙酮进口明显变化[N];中国石化报;2008年
4 钟桦;国际丙酮市场逐步复苏[N];中国贸易报;2009年
5 饶兴鹤;全球丙酮产能将过剩20万吨[N];中国化工报;2010年
6 艾抚宾 王晓峰;丙酮一步法合成MIBK成套技术开发完成[N];中国石化报;2009年
7 特约记者 郑伟;丙酮一步法合成MIBK升级换代[N];中国化工报;2009年
8 百克;丙酮市场交易平稳[N];中国化工报;2010年
9 百克;丙酮市场盘整运行[N];中国化工报;2010年
10 东方证券 庄琰 杨云;国际化肥继续上涨 甲醇醋酸大幅提价[N];证券时报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘雪姣;应用定量蛋白质组学方法研究代谢综合征早期肾损害尿液蛋白标志物[D];北京协和医学院;2012年
2 罗勇;瘢痕疙瘩差异表达基因的筛选及标志蛋白的分析[D];第一军医大学;2005年
3 徐红波;基于iTRAQ技术筛选抑郁症相关血浆蛋白和氨基酸的初步研究[D];重庆医科大学;2012年
4 周继红;应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术筛选肺癌差异蛋白的研究[D];广西医科大学;2010年
5 李莉;蛋白质组学技术对胃癌、肝癌、卵巢癌血清差异蛋白表达的研究[D];新疆医科大学;2011年
6 张旭华;iTRAQ定量蛋白质组学在结直肠癌患者血清中的应用研究[D];山东大学;2012年
7 吴靖宇;不同1p杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究[D];复旦大学;2012年
8 徐洪;Ac-SDKP抗矽肺纤维化作用的新靶向—肌成纤维细胞分化和差异蛋白的筛选[D];河北医科大学;2012年
9 郄良毅;地高辛对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞作用的蛋白质组学研究[D];山东大学;2009年
10 杨旭芳;人脂肪干细胞的获取及其定向分化为内皮细胞差异蛋白筛选的实验研究[D];吉林大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 朱传智;基于iTRAQ技术的结核分枝杆菌定量蛋白质组学研究[D];西南大学;2012年
2 龙强;龙眼(Dimocarpus longan Lour.)成花逆转蛋白质组学的初步研究[D];福建农林大学;2006年
3 吕慧;AFB_1/HBV双暴露相关肝癌分子标志物的筛选及差异蛋白的表达验证[D];广西医科大学;2012年
4 丁春燕;变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的基因组比较[D];天津医科大学;2006年
5 付琦;绵羊肺炎支原体PCR快速检测方法的建立及其P40蛋白的抗原性研究[D];河北农业大学;2008年
6 王昆鹏;春小麦杂种后代农艺性状和高分子量谷蛋白亚基组成分析[D];内蒙古农业大学;2009年
7 董杜鹃;棉铃虫组织蛋白酶B及前导肽的重组表达及性质研究[D];山东大学;2005年
8 顾春华;抗菌肽DCD-1L的随机突变及在毕赤酵母中的表达[D];兰州大学;2006年
9 戴悦婵;抗岩沙海葵毒素单克隆抗体的制备以及鉴定[D];广州医学院;2009年
10 刘英丽;猪囊尾蚴cYI基因重组子的建立及表达[D];河北医科大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026