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《北京协和医学院》 2012年
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白藜芦醇对Pristane诱导狼疮鼠作用研究

王卓龙  
【摘要】:研究背景和目的 SLE是一种累及全身多系统器官组织的自身免疫性疾病,血清中存在以抗核抗体、抗dsDNA抗体为代表的多种自身抗体。肾脏是最常受累的器官。CD4+T细胞异常活化持续刺激B细胞产生自身抗体,致病性抗体通过II型免疫反应引起组织器官损伤和血循环中抗原抗体复合物在组织器官沉积或原位形成的抗原抗体复合物激活补体,引起细胞浸润、凝血因子活化和炎症介质释放损伤组织器官是导致SLE发病的重要机制。目前治疗SLE主要使用免疫抑制剂如糖皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢素、吗替考酚酯等,使SLE患者的预后有了很大改观,但是它们对机体免疫反应的抑制缺乏选择性和特异性,长期应用存在较多毒副作用包括降低机体抵抗力诱发感染、影响生殖系统功能、抑制骨髓造血功能、增加肿瘤发生率等;近年来人们对生物制剂治疗SLE作了大量研究,抗CD20单抗己被用于治SLE但其价格昂贵,其远期收益与风险仍难以评价;此外还有相当部分SLE患者对这些药物疗效差,SLE仍然严重危害着人类健康,因此研究更安全有效治疗SLE新方法甚为重要。 白藜芦醇(3,5,4-三羟基苯二烯)广泛存在于植物和水果中,由于发现它具有心血管保护作用而受到人们重视。大量研究表明它具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、基因沉默和免疫调节作用。白藜芦醇是Sirtl(依赖NAD的去乙酰化酶)特异性激动剂,基因Sirtr-/-敲除鼠会出现自发性自身免疫状态,血清中出现高滴度抗核抗体,肾脏中出现免疫球蛋白IgG沉积,表现为免疫复合物性肾炎,与SLE表现类似。动物实验显示白藜芦醇能减轻胶原诱导DBA1鼠关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎、右旋聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎病情。它抑制人和小鼠T细胞活化和增殖,抑制B细胞活化增殖和抗体产生;抑制免疫细胞共刺激分子CD40.CD80.CD86和MHCI和Ⅱ类分子表达,诱导淋巴细胞凋亡,抑制细胞因子如IL-2、IL-6、IL-17、INF-γ和TNF-α等产生,抑制环氧合酶2(COX-2)。白藜芦醇的这些作用显示其可能具有潜在的治疗SLE的功效。但至今尚无有关白藜芦醇对SLE和狼疮模型作用的研究报道。本研究目的是了解白藜芦醇对Pristane诱导狼疮鼠是否具有预防保护作用。 方法 1.建立pristane诱导狼疮鼠模型。方法是将BALB/c鼠(SPF级,雌性,9-10周龄)随机分成二组:(1)诱导组;一次性给BALB/c鼠腹腔注射Pristane0.5ml;(2)正常对照组:一次性给BALB/c鼠腹腔注射生理盐水0.5m1。观察时间为7月。观察项目包括小鼠一般情况、尿蛋白、血清自身抗体(抗核抗体、抗ds-DNA抗体、抗RNP/Sm抗体、抗ssDNA抗体)、肾脏病理变化和免疫球蛋白在肾小球沉积情况等。比较诱导组和对照组之间上述项目变化。 2.观察白藜芦醇对Pristane诱导狼疮鼠是否具有预防作用。方法是将BALB/c鼠(SPF级,雌性,9-10周龄)随机分为三组:(1)白藜芦醇A组:均一次性腹腔注射Pristane0.5ml,次日起灌服白藜芦醇50mg/kg/d。(2):白藜芦醇B组:均一次性腹腔注射Pristane0.5ml,次日起灌服白藜芦醇75mg/kg/d。(3):模型对照组:均一次性腹腔注射Pristane0.5ml。观察时间为7月。观察项目包括小鼠一般情况、尿蛋白、血清自身抗体(抗核抗体、抗ds-DNA抗体、抗RNP/Sm抗体),肾脏病理和免疫球蛋白在肾小球沉积变化等。比较各组之间上述项目变化。 3.体外实验研究白藜芦醇对狼疮鼠CD4+T淋巴细胞功能的影响。(1)无菌分离Pristane诱导狼疮鼠脾脏单个核细胞。脾脏单个核细胞与不同浓度梯度(10μM、20μM、40μM、80μM)的白藜芦醇共同孵育30分钟后,分别采用刀豆蛋白A、抗CD3抗体、抗CD3/CD28抗体活化继续培养,6-12小时后收集细胞利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术检测CD4+T细胞CD69的表达;培养36小时后收集细胞检测CD4+T细胞CD71的表达。(2)利用磁珠分选法从脾脏单个核细胞中分离CD4+T淋巴细胞,加入不同浓度梯度(10μM、20μM)的白藜芦醇后继续培养36小时后,用Annexin V/PI双染色法结合流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞凋亡。(3)新鲜分离的脾脏单个核细胞、CD4+T淋巴细胞分别进行CFSE染色后加入不同浓度梯度(10μM\20μM、40μM、80μM)的白藜芦醇共同孵育30分钟,再进行刺激培养4天(单个核细胞和刀豆蛋白A共培养,CD4+T细胞和重组小鼠IL-2、抗CD3、抗CD28抗体共培养),最后流式细胞术检测细胞增殖情况。(4)新鲜分离的脾脏单个核细胞与不同浓度梯度(20μM、40μM、80μM)的白藜芦醇共同孵育2小时后,与PMA、Iono共培养,利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术检测Th1、Th2、Th17。 结果 1.诱导组BALB/c鼠出现红斑(5/10)、尿蛋白(8/10),血清抗核抗体、抗ds-DNA抗体、抗RNP/Sm抗体较对照组增高,差异有统计学意义(P0.05)。光镜下发现诱导组小鼠部分肾小球出现炎症变化:免疫荧光检查发现肾小球有免疫球蛋白(IgG、IgM)沉积;正常对照组小鼠肾小球无上述变化。这些结果提示Pristane可诱导BALB/c鼠发生狼疮。 2.模型对照组鼠出现红斑(5/10)、尿蛋白(8/10);肾脏病理光镜下部分肾小球出现炎症;免疫荧光检查发现肾小球有免疫球蛋白(IgG、IgM)沉积。白藜芦醇A组鼠未出现红斑,尿蛋白(4/10)较对照组鼠减轻,经统计学检验有显著性差异(P0.05)。白藜芦醇A组鼠肾小球出现炎症、细胞增生程度和肾小球免疫球蛋白(IgG、IgM)沉积程度比模型对照组鼠轻。白藜芦醇B组鼠病情变化与白藜芦醇A组类似,和模型对照组比较上述指标明显减轻,有显著性差异。但白藜芦醇B组和白藜芦醇A组之间比较上述指标差异无统计学意义。上述结果提示白藜芦醇对Pristane诱导狼疮鼠具有预防保护作用。但白藜芦醇A组和白藜芦醇B组血清抗核抗体、抗ds-DNA抗体、抗RNP/Sm抗体、血清IFN-α水平较虽比模型对照组下降,但无统计学意义。 3.体外实验结果显示ConA、抗CD3抗体、抗CD3/CD28抗体刺激均可使狼疮鼠CD4+T细胞表达CD69、CD71明显增强。白藜芦醇(浓度10μM、20μM、40μM、80μM)均可显著抑制由抗CD3抗体活化引起的CD4+T淋巴细胞CD69表达(P0.05)。白藜芦醇(浓度20μM、40μM、80μM)均可显著抑制由ConA、抗CD3/CD28抗体活化引起的CD4+T淋巴细胞CD69表达(P0.05),并且随着白藜芦醇浓度增加,其抑制作用呈现出增强趋势(P0.05)。 ConA、抗CD3抗体、抗CD3/CD28抗体刺激均可使狼疮鼠CD4+T细胞表达CD71明显增强。白藜芦醇(浓度10μM、20μM、40μM、80μM)均可显著抑制由ConA活化引起的CD4+T淋巴细胞CD71表达(P0.05)。白藜芦醇(浓度20μM、40μM、80gM)均可显著抑制分别由抗CD3抗体、抗CD3/CD28抗体活化引起的CD4+T淋巴细胞CD71表达(P0.05),并且随着白藜芦醇浓度增加,其抑制作用呈现出增强趋势(P0.05)。 4.白藜芦醇(浓度10μM、20μM、40μM、80μM)均具有诱导CD4+T淋巴细胞凋亡的作用,并且随着浓度增加,诱导细胞凋亡作用呈现出增强趋势(P0.05)。 5.白藜芦醇(浓度10μM、20μM、40μM、80μM)能显著抑制脾单个核细胞增殖,白藜芦醇(浓度20μM、40μM、80μM)可显著抑制CD4+T淋巴细胞,并且随着白藜芦醇浓度增加,对两者增殖抑制作用呈现出增强趋势(P0.05)。 6.20μM、40μM、80μM白藜芦醇均可抑制CD4+T细胞向Thl分化,随着白藜芦醇浓度增加,抑制作用增强,Thl及Th1/Th2比值呈下降趋势(P0.05)。白藜芦醇对Th2和Th17作用经检验无统计学意义(P0.05)。 结论 Pristane可诱导BALB/c鼠发生狼疮,白藜芦醇对Pristane诱导小鼠发生狼疮具有预防作用,它具有抑制CD4+T细胞的活化、增殖,诱导其凋亡的作用,具有抑制CD4+T淋巴细胞向Thl分化,降低Thl/Th2比值作用。白藜芦醇有可能是代表着新的潜在的治疗SLE的药物。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R285.5;R593.241

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