重组人IFN-λ1的制备及其抗肿瘤活性的研究

【摘要】：干扰素-λs (Interferon-λ, IFN-λs)是近年来发现的一类新型干扰素,在氨基酸组成和功能方面与Ⅰ型IFN接近。IFN-λs的受体隶属于Ⅱ型细胞因子受体家族(Class Ⅱ cytokine receptor family, CRF2),由特有的配基结合亚基IFN-λR1和辅助亚基IL-10R2组成。尽管IFN-λs与Ⅰ型IFN (IFN-α/β)使用完全不同的受体,但是均可通过激活JAK-STAT通路传递配基结合信号,因此IFN-λs显示出了与Ⅰ型IFN相似的抗病毒,抗肿瘤及免疫调节活性。值得注意的是,与Ⅰ型IFN受体不同,IFN-λR1的表达具有组织特异性,在骨髓造血细胞及脑、脊髓中枢神经细胞表达量很低。这一特点使IFN-λs可望成为一种新型的免疫生物制剂,与目前临床上普遍应用的IFN-α相比,在发挥生物活性的同时有效地减少发热、抑郁及骨髓抑制等副作用。 本组前期工作中,以串联多拷贝的形式构建IFN-λ1表达载体并分泌到胞外的形式用毕赤酵母成功的表达了重组人IFN-λ1(recombinant human IFN-λ1, rhIFN-λ1),并对其生物活性进行了初步的研究。前期研究表明,rhIFN-λ1能够诱导细胞中JAK-STAT信号通路中STAT蛋白的磷酸化,并对某些细胞的增殖有一定的抑制作用；但存在着重组蛋白rhIFN-λ1表达产量、纯化效率有待提高,靶细胞尚不完全明确等问题。本论文在此基础上,在rhIFN-λ1的表达纯化流程的优化,理化性质的鉴定和抗肿瘤活性以及N糖基化位点突变后的性质的观察等几个方面做了进一步的研究。 本论文的第一部分工作是利用BMMY培养基高效表达rhIFN-λ1,经阳离子交换层析(SP Sepharose Fast Flow, SP FF)及分子筛层析(Superdex75)两步柱层析纯化,获得纯度较高的rhIFN-λ1。对纯化步骤作了产率和纯度分析后,又就重组蛋白的分子量、N端序列、等电点、肽质量指纹图谱及二硫键位置等理化性质做了进一步鉴定。此外,本部分工作还研究了rhIFN-λ1在体内外的抗肿瘤作用。以人结肠癌细胞HCT116和HT29两株细胞为实验对象。通过Real-Time PCR和Western Blot分析了两株细胞中IFN-λR1在mRNA和蛋白水平上的表达情况。通过MTT检测rhIFN-λ1抑制细胞增殖实验,发现rhIFN-λ1对两种细胞的抑制作用呈明显的剂量依赖效应。此外,rhIFN-λ1还能引起两株细胞中STAT的磷酸化并诱导两株细胞的凋亡。体内实验结果显示rhIFN-λ1的抑瘤率有明显的剂量依赖效应,肿瘤抑制率分别达到52%(HCT116)和56%(HT29), P值均小于0.01；之后我们对不同剂量组的肿瘤进行了Ki-67的免疫组化实验,结果显示随着干扰素剂量的增加Ki-67指数呈明显的下降趋势。此外,我们还做了脾脏组织的HE染色和CD45R和CD3的免疫组化实验,结果证明脾脏中的B细胞生发中心明显增大,数量也明显增多,但由于所用裸鼠为T细胞免疫缺陷,所以未发现CD3明显变化。 本论文的第二部分工作是利用重叠延伸PCR定点突变技术将IFN-λ1蛋白质序列中N-糖基化位点46位Asn(天冬酰胺)突变为与其具有相似结构的Gln(谷氨酰胺),并构建了6拷贝IFN-λ1-Nm (N46Q)表达载体,在转化的毕赤酵母中分泌性表达了重组蛋白,并通过SPFF和Superdex75两步层析,获得了高纯度的低糖化重组人IFN-λ1(IFN-λ1-Nm)。理化性质的鉴定显示rhIFN-λ1的N-糖基化位点突变后对其理化性质并无明显影响。通过对细胞表面HLA-ABC表达的检测及双荧光素酶报告基因分析,发现干扰素突变体与突变前重组蛋白具有基本相同的生物活性。在此基础上,我们进行了小鼠急性毒性实验,给药剂量达10mg/kg,未发现小鼠死亡,所有小鼠体重增长正常,表现了较好的安全性。 本研究为rhIFN-λ1进入中试生产及生物新药的研发奠定了基础。

【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R94;R96