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《北京协和医学院》 2011年
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Oct4对肿瘤干细胞成瘤能力和多向分化潜能的影响

贾勇圣  
【摘要】:第一部分Oct4对肿瘤干细胞成瘤能力和多向分化潜能的影响 越来越多的证据表明,肿瘤组织中存在具有肿瘤发生,对肿瘤形成和生长转移发挥重要作用的细胞亚群,被称为肿瘤干细胞。虽然近年来对肿瘤干细胞中基因调控和信号转导的研究已经取得了一些进展,但是对肿瘤干细胞分子生物学的特性以及它们对肿瘤的发生、发展及其调控机理尚不明了。Oct4是与胚胎干细胞自我更新和多向分化潜能密切相关的基因,提示Oct4可能在肿瘤干细胞的干性维持中发挥重要作用。 目的:研究Oct4在肿瘤干细胞成瘤能力和多向分化潜能中的作用及可能的相关机制。 方法:通过RT-PCR和Western blotting的方法比较肿瘤干细胞T3A-A3,肝癌细胞BEL-7402,SMMC-7721和HepG2以及永生化人肝窦内皮细胞LSEC中Oct4mRNA和蛋白的表达。通过慢病毒转导的方法在T3A-A3中敲降Oct4表达,应用平板克隆形成和流式细胞周期分析比较慢病毒shOct4对T3A-A3细胞增殖的影响;采用D半乳糖苷酶染色和p16免疫荧光染色检测Oct4敲降后T3A-A3出现的细胞衰老;评价敲降Oct4对T3A-A3细胞形成肿瘤球能力的影响。 另外,通过转导慢病毒pWPTS-Oct4,在肝癌细胞HepG2中异位表达Oct4,用MTT方法比较异位表达Oct4后对HepG2细胞增殖能力的影响。 通过体内成瘤实验分析比较敲降Oct4对T3A-A3细胞成瘤能力的影响,以及异位表达Oct4对HepG2细胞成瘤能力的影响,并通过免疫组织化学染色的方法检测了肿瘤组织中Oct4和PCNA的表达。 最后,我们观察了敲降Oct4对肿瘤干细胞T3A-A3多向分化潜能的影响。比较T3A-A3和Oct4敲降后的T3A-A3细胞,在黑色素瘤和淋巴瘤组织条件培养基诱导培养21天后,通过RT-PCR, Western Blotting,细胞免疫荧光染色分别在基因,蛋白和细胞水平检测黑色素瘤标记物gp100,淋巴瘤标记物CD10的表达。 结果:与肝癌细胞株比较,肿瘤干细胞T3A-A3中的Oct4表达水平最高,并且Oct4表达水平与肝癌细胞的成瘤能力存在着一定的正相关性。在T3A-A3细胞中敲降Oct4表达后,T3A-A3细胞平板克隆形成能力减弱,出现G1期周期阻滞和细胞衰老,并且细胞在裸鼠皮下移植瘤的生长速度明显降低。敲降Oct4后,T3A-A3细胞在无血清低粘附细胞培养板中形成肿瘤球的数目和大小明显降低,裸鼠皮下成瘤能力明显减弱。而在HepG2细胞中异位表达Oct4后,HepG2细胞的增殖能力和肿瘤形成能力明显提高。肿瘤干细胞多向分化潜能实验表明:敲降Oct4后,T3A-A3细胞在黑色素瘤和淋巴瘤组织条件培养基诱导培养后没有出现黑色素瘤标记物gp100,淋巴瘤标记物CD10的表达,表明细胞丧失了多向分化的潜能。 结论:Oct4是调节肿瘤干细胞成瘤能力和多向分化潜能的关键基因,在肿瘤的发生、发展以及分化过程中发挥重要作用,Oct4可能成为未来肿瘤治疗的新靶点。 第二部分miR-145对肿瘤干细胞成瘤能力的影响 在肿瘤中肝癌的死亡率已跃居第三位,原发性肝癌中85-90%是肝细胞肝癌,是全世界的第5大恶性肿瘤,虽然在肝细胞肝癌的研究中取得了一定的进展,但是肝细胞肝癌复发转移和5年生存率低下仍然是目前肝癌治疗的难题。近来的研究发现,一类被称作microRNA (miRNA)的小分子RNA通过调控其下游与细胞增殖和死亡相关的靶基因在肿瘤发生发展中发挥重要作用。新近发现miR-145可以接受抑癌基因p53调控,在胚胎干细胞中调控细胞重编程基因Sox2,Oct4和Klf4的表达,以上证据提示miR-145很可能在肿瘤干细胞中也发挥重要作用。 目的:探讨miR-145对肿瘤干细胞T3A-A3成瘤能力的影响及相关作用机制。 方法:通过实时定量PCR的方法在肿瘤干细胞T3A-A3,肝癌细胞BEL-7402和永生化肝窦内皮细胞LSEC中检测miR-145的表达。然后转导慢病毒Lenti-miR-145在T3A-A3中恢复miR-145的表达,通过平板克隆形成和流式细胞周期检测Lenti-miR-145对T3A-A3细胞增殖的影响;采用p半乳糖苷酶染色和p16免疫荧光染色检测Lenti-miR-145转导后出现的T3A-A3细胞的衰老。通过肿瘤球形成实验检测miR-145对T3A-A3细胞自我更新能力的影响。 在动物水平观察miR-145对T3A-A3肿瘤形成和生长的影响,观察miR-145对T3A-A3细胞裸鼠皮下成瘤能力和肿瘤生长速度的影响,并应用免疫组织化学染色检测肿瘤组织中Oct4和PCNA的表达。 为发现miR-145作用的信号通路,通过RT-PCR和Western blotting检测miR-145对肿瘤干细胞T3A-A3中Oct4表达的影响,并通过在Lenti-miR-145转导的T3A-A3细胞导入Oct4,使用MTT和裸鼠皮下移植瘤的方法观察Oct4是否可以翻转miR-145的肿瘤抑制作用。 结果:与肝癌细胞BEL-7402和永生化肝窦内皮细胞LSEC相比,肿瘤干细胞T3A-A3中的miR-145的表达水平最低,miR-145表达水平与肿瘤细胞的肿瘤生长能力存在着一定的负相关性。在T3A-A3中恢复miR-145表达后,T3A-A3细胞平板克隆形成能力减弱,出现G1期周期阻滞和细胞衰老,裸鼠皮下移植瘤的生长速度明显降低。另外恢复miR-145表达后,T3A-A3细胞在无血清低粘附细胞培养板中形成肿瘤球的能力明显降低,在裸鼠皮下形成肿瘤的能力明显减弱。T3A-A3细胞中miR-145表达水平的增高伴随着Oct4蛋白表达水平的降低,Oct4的导入可以分别在细胞和动物水平部分抵消miR-145的肿瘤抑制作用。 结论:我们的研究结果表明miR-145可以通过靶向抑制Oct4蛋白的表达调节肿瘤干细胞的生长和成瘤能力。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R730.2

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