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《北京协和医学院》 2014年
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基于聚谷氨酸构象转变构建纳米靶向复合胶束及其抗黑色素瘤研究

王启明  
【摘要】:本文应用构象可变的聚谷氨酸—聚乳酸嵌段共聚物和Tat肽修饰的聚乙二醇—二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物构建了纳米靶向复合胶束。通过自组装方式,借助盐酸阿霉素与复合胶束内核高分子材料链段间的相互作用实现载药,并将载药复合胶束用于抗黑色素瘤研究。已有研究发现Tat肽具有较强的跨膜递送能力,但其作用方式缺乏靶向性。此外,Tat肽酶解稳定性差,酶解后跨膜递送能力显著降低。为了解决上述问题,本文合成了构象可变的聚谷氨酸—聚乳酸嵌段共聚物。在血液循环中,聚谷氨酸链段可以屏蔽Tat肽的跨膜递送功能,防止其针对正常细胞发挥跨膜递送作用。同时,这种屏蔽作用还可以保护Tat肽,防止其被酶解,失去跨膜递送活性。肿瘤(实体瘤)组织特有的EPR效应可增加药物载体在瘤体内的蓄积,实现靶向肿瘤递送药物的目的。在肿瘤组织弱酸性条件下,聚谷氨酸链段可发生构象转变,从而选择性的暴露Tat肽,靶向肿瘤细胞发挥Tat肽的跨膜递送作用,促进药物载体(药物)吸收。聚谷氨酸的构象转变还可以在胶束外壳中形成通道,加速药物释放。 研究过程中,首先以L-谷氨酸-γ-苄酯N-羧基环内酸酐为单体,端胺基聚乳酸为引发剂,经阴离子开环聚合反应和氢溴酸脱苄基保护,制得两种聚谷氨酸—聚乳酸嵌段共聚物,PGA5.6K-b-PLA1.8K和PGA12K-b-PLA6K。此外,通过巯基与马来酰亚胺双键间的Michael加成反应将Tat肽键合在聚乙二醇—二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物的聚乙二醇端,反应产率为91%。应用核磁共振波谱、红外光谱、凝胶渗透色谱和圆二色谱法分别对合成产物和中间体的化学结构,分子量(分子量单分散性)与构象进行表征。 分别应用两种聚谷氨酸—聚乳酸嵌段共聚物与Tat肽修饰的聚乙二醇—二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物(Tatp-PEG3.5K-b-DSPE),聚乙二醇—二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物(PEG2K-b-DSPE)制备空白复合胶束,h-PMs-1(含PGA5.6K-b-PLA1.8K)和h-PMs-2(含PGA12K-b-PLA6K)。在pH6.5弱酸性环境中,h-PMs-1复合胶束可发生构象变化(由PGA5.6K-b-PLA1.8K引发),使胶束粒径减小;并暴露胶束外壳中的Tat肽,使胶束电位升高。h-PMs-2复合胶束的无构象变化,无法充分暴露Tat肽,因此粒径减小与电位升高的幅度均明显小于h-PMs-2胶束。 应用上述两种空白复合胶束,采用透析法分别制备了阿霉素纳米靶向复合胶束,D-h-1(含PGA5.6K-b-PLA1.8K)和D-h-2(含PGA12K-b-PLA6K)。两种载药复合胶束粒径分别为95±1.72nm和165±1.55nm(pH7.4,强度径),载药量分别为9.82±1.01%和9.92±0.64%(质量百分比)。体外释放研究显示,两种复合胶束均呈现pH依赖性释药行为。随着pH值的降低(pH7.4至5.5),聚谷氨酸链段发生构象转变,于复合胶束外壳中形成释药通道,加速药物释放。pH5.5介质中,聚谷氨酸共聚物含量增加导致通道增多,进一步加速阿霉素释放。pH7.4的环境中,聚谷氨酸共聚物未发生构象转变,无法形成释药通道,因此药物释放速率并未随着聚谷氨酸共聚物含量的增加而改变。 流式细胞术和激光共聚焦技术用于考查纳米靶向复合胶束的细胞摄取行为。两项研究共同证实pH7.4的条件下聚谷氨酸链段可抵抗酶解,保护Tat肽的活性。同时,这种保护作用还可屏蔽Tat肽的跨膜递送作用。pH6.5时D-h-1复合胶束(含PGA5.6k-b-PLA,.8k)可通过构象转变暴露Tat肽,从而靶向肿瘤细胞外特有的弱酸性微环境发挥Tat肽的跨膜递送功能,增加载药胶束的吸收。同样条件下,D-h-2复合胶束(含PGA1ZK-b-PLA6K)的构象无变化,因此细胞对D-h-2复合胶束的摄取量显著低于前者。 细胞药效学考查显示,增加细胞对载药复合胶束的摄取将提高药物的细胞毒作用、诱导细胞凋亡作用和抑制细胞迁移能力。D-h-1复合胶束可显著性降低线粒体内跨膜电位,进而诱导A375细胞凋亡。该复合胶束在细胞划痕实验中也显示了较强的抑制A375细胞移行的能力。D-h-2复合胶束的细胞毒性、诱导细胞凋亡能力,以及抑制A375细胞移行的能力均明显弱于D-h-1复合胶束。 最后,本文应用A375人黑色素瘤细胞荷瘤裸鼠模型评价不同载药复合胶束的体内药效学作用,并应用近红外成像技术考查不同载药复合胶束的体内分布。研究结果显示,D-h-1复合胶束对A375黑色素瘤生长具有较强的抑制作用,荷瘤鼠生存期延长(接种73天后全部死亡),并有效维持荷瘤鼠体重。成像研究显示,单次静脉注射后,24小时内可在肿瘤部位观察到D-h-1复合胶束的强荧光信号,而其他各主要脏器无荧光信号。相反,D-h-2复合胶束对瘤块的生长抑制作用较弱,生存期缩短(接种54天后全部死亡),体重降低。成像研究显示,静注24小时后肿瘤组织内荧光基本消失,而肝脏中却显示胶束的荧光信号。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R739.5

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