新型疫苗佐剂低分子量肝素钠及帕米膦酸佐剂效应研究

【摘要】：在疫苗的使用中,佐剂具有重要的作用。随着分子生物学技术的发展,佐剂的研发也得到了极大地促进,新型佐剂层出不穷,例如CpG二寡聚核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)佐剂,免疫刺激复合物(Immunostimulating complex,ISCOM)佐剂,纳米佐剂以及Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)依赖型佐剂相继出现。尽管佐剂的种类繁多,但目前被批准用于临床使用的仍然很少,且认证使用的包括铝佐剂在内的佐剂在使用中仍然具有着局限性,例如无法有效的增强细胞免疫、引起局部刺激症状等不良反应。因此,开发安全性高、对体液免疫和细胞免疫均有较好增强作用的新型疫苗佐剂具有重要的意义。低分子量肝素钠(Low molecular weight heparin sodium,LMWH-Na)和帕米膦酸(Pamidronic acid,PAD)是临床上分别作为抗凝血剂和治疗骨疾病的两种药物,LMWH-Na属于糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)家族中肝素类物质,PAD属于双膦酸盐物质。近年来,研究人员发现肝素类物质和双膦酸盐具有多种生物功能,例如免疫调节作用和抗肿瘤作用,尤其是两者的免疫调节作用受到许多研究人员的青睐,并且在机制研究上也取得了一定的成果。另外,LMWH-Na和PAD结构成分明确,易于生产、保存和运输,且作为临床药物具有一定的安全性,因此,具有作为佐剂的潜力。基于肝素类药物以及双膦酸盐的免疫调节作用,本实验旨在初步探讨LMWH-Na和PAD作为佐剂对甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响。实验中将甲型肝炎减毒活疫苗HepA-1(18 EU)与5种不同剂量的LMWH-Na以及4种不同剂量的PAD分别混合作为实验组,并取生理盐水作为阴性对照组、HepA-1(18 EU)作为阳性对照组、HepA-1混合Al (OH) 3 (300μg)作为铝佐剂对照组,于0周经背部皮下注射,共免疫一次,并在免疫后第4、8、12、16周进行尾静脉采血,采用ELISA法检测小鼠血清中抗-HAV抗原特异性IgG抗体水平。在实验期间,对小鼠的健康状况进行观察,并于实验结束时,取阴性对照组以及LMWH-Na和PAD最大剂量组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏各主要器官制作病理切片进行对比观察。实验结果表明,LMWH-Na具有一定的佐剂效应,其佐剂效应随着时间的延长而增加,至第8周达到高峰,LMWH-Na的佐剂效应并不是随着注射剂量的升高而增加,而是在10 μL/只时具有最佳效果,但其佐剂效应不如铝佐剂。PAD的佐剂效果不佳,PAD各剂量组实验小鼠的抗-HAV IgG水平在所测各时间点较阳性对照组没有大幅度增高,表明实验组小鼠使用PAD作为免疫佐剂后体液免疫效应未有显著增强。分析认为,虽然实验结果显示PAD的佐剂效应不佳,但这并不意味着其不具有佐剂效应,而可能是由于实验小鼠的鼠龄较小,体内免疫系统的发育并没有完全成熟造成的,也可能是由于所选择的PAD剂量不合适,从而不能完全发挥增强体液免疫的作用。下一步实验将从这两方面入手,探讨PAD作为佐剂的可能性。在佐剂的安全性试验中,实验期间小鼠未出现蜷缩、竖毛、搔鼻、抽搐等明显异常,阴性对照组和LMWH-Na实验组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织病理分析均未观察到明显病变。阴性对照组和PAD实验组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏组织病理分析均未观察到明显病变,表明LMWH-Na和PAD安全性良好。