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《北京协和医学院》 2016年
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小续命汤有效成分组对缺血性脑卒中恢复早期的神经保护作用研究

路畅  
【摘要】:脑卒中(stroke),又称脑血管意外,是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病,其临床表现主要以猝然昏厥、口眼歪斜、半身不遂、舌强言蹇和智力障碍为特征。流行病学研究显示,缺血性脑卒中的发病率占所有脑卒中的60-80%,并且以每年8.7%的速率增长,而出血性脑卒中的发病率以每年1.7%的速率降低。随着我国老龄化人口的增多,缺血性脑卒中发病率呈现逐年上升的趋势。然而,由于缺血性脑卒中发病的病理进程复杂,迄今为止,正式被批准使用的安全有效的治疗药物还为数不多。许多研究证实,线粒体通过多种机制在缺血性脑卒中病理生理进程中扮演着重要的角色,是缺血性损伤的重要亚细胞靶标。中药复方小续命汤是中医从外风论治疗缺血性脑卒中的经典有效方剂。小续命汤有效成分组包含中药复方小续命汤中所有与其治疗脑缺血损伤密切相关的药理活性组分。因此,我们采用大脑中动脉暂时闭塞所致脑缺血再灌注大鼠为观察对象,从整体水平上考察中药复方小续命汤有效成分组对缺血性脑卒中的保护作用,探讨线粒体在缺血性脑卒中发生发展中的作用。第一部分小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠恢复早期的总体保护作用研究目的 考察小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠恢复早期的总体保护作用。方法选用健康雄性SD大鼠,采用插线法制备大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型,缺血2h后实现再灌注。应用Zea-Longa's级标准评分法评价动物脑缺血程度,将造模成功的大鼠随机分为模型组、小续命汤有效成分低、中、高剂量组和阳性药银杏叶提取物EGb 761组,以假手术大鼠作为对照组,术后1~14天灌胃给药,每日一次。通过Zea-Longa's级标准评分、改良神经功能缺损评分(mNSS)和转角实验(CT)等系列行为学评价手段来评测小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠不同恢复时期行为学的变化,每天一次,连续测定14天。选用TTC染色法观察大鼠脑梗死体积百分比和半球肿胀。结果与模型组相比,随着给药时间延长,小续命汤有效成分组能够降低MCAO大鼠神经功能缺损评分,表现为大鼠前后肢屈曲程度降低,行走趋于正常,在平衡木上停留时间增长,感觉功能恢复灵敏,转角实验中MCAO大鼠向右转向的比率接近正常;其中自MCAO术后5天起,小续命汤有效成分组能明显改善MCAO大鼠上述神经行为学表现,与模型组相比差异具有显著性(P0.05,P0.01)。同时小续命汤有效成分组能够明显减少术后5天和14天缺血再灌注大鼠脑组织梗死体积百分比(P0.01),缩小术后5天缺血再灌注大鼠的半球肿胀(P0.01)。结论 小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠损伤恢复早期即产生神经保护作用。第二部分小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠恢复早期脑组织氧化还原水平失衡的影响目的 考察小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠恢复早期脑组织氧化还原水平失衡的影响。方法选用健康雄性SD大鼠,采用插线法制备大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型,缺血2h后实现再灌注。应用Zea-Longa's级标准评分法评价动物脑缺血程度,将造模成功的大鼠随机分为模型组、小续命汤有效成分低、中、高剂量组和阳性药银杏叶提取物EGb 761组,以假手术大鼠作为对照组,术后1-5天灌胃给药,每日一次。提取分离给药5天后MCAO大鼠缺血半暗带和核心区脑组织,通过测定脑组织内蛋白质羰基含量、丙二醛(MDA)含量以及一氧化氮合酶(NOS)活性,来评估小续命汤有效成分组对缺血再灌注大鼠脑组织氧化应激损伤的改善作用。通过测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等内源性抗氧化酶的活力和还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)等内源性抗氧化剂的含量变化,来研究小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠内源性抗氧化系统的保护作用。结果与模型组相比,小续命汤有效成分组给药5天后,能够显著降低MCAO大鼠脑组织中一氧化氮合酶(NOS)活性(P0.05),明显降低丙二醛(MDA)和蛋白羰基含量(P0.05,P0.01),缓解缺血再灌注后大鼠脑组织氧化应激损伤;与此同时,小续命汤有效成分组能够显著提高大鼠脑组织过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)以及谷胱甘肽还原酶(GR)的活性(P0.05,P0.01),但对还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量影响不明显。结论小续命汤有效成分组能够调节局灶性脑缺血再灌注大鼠恢复早期脑组织氧化-抗氧化系统平衡,从而对大鼠脑神经元细胞的起到保护作用。第三部分小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠恢复早期脑线粒体功能损伤的影响目的 考察小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠恢复早期脑线粒体功能损伤的影响。方法选用健康雄性SD大鼠,采用插线法制备大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型,缺血2 h后实现再灌注。应用Zea-Longa's级标准评分法评价动物脑缺血程度,将造模成功的大鼠随机分为模型组、小续命汤有效成分低、中、高剂量组和阳性药银杏叶提取物EGb 761组,以假手术大鼠作为对照组,术后1-5天灌胃给药,每日一次。提取分离给药5天后MCAO大鼠缺血侧大脑(除缺血核心区外),通过测定线粒体的氧化磷酸化功能、线粒体呼吸酶活性(琥珀酸脱氢酶SDH、细胞色素C氧化酶COX)、线粒体ROS含量、膜电位、线粒体PT孔的开放程度和ATP含量,研究小续命汤有效成分组对缺血再灌注大鼠线粒体功能的影响。同时,提取分离给药5天后MCAO大鼠缺血半暗带和核心区脑组织,Western Blot法检测线粒体启动的凋亡通路相关蛋白,包括Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax等,研究小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠线粒体凋亡相关蛋白表达的影响。结果与模型组相比,小续命汤有效成分组给药5天后,能够显著改善缺血再灌注大鼠脑线粒体的呼吸活力(P0.05,P0.01),显著提高线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性(P0.05),降低线粒体ROS的含量(P0.05,P0.01),明显提高脑线粒体膜电位(P0.05)和促进脑组织ATP的合成(P0.05),但对脑线粒体膜肿胀度和细胞色素C氧化酶(COX)的影响不明显。与模型组相比,小续命汤有效成分组给药5天后,能够显著下调促凋亡蛋白Bax,上调抑制凋亡蛋白Bcl-2(P0.05, P0.01);与此同时,小续命汤有效成分组能够显著上调Caspase-3和Caspase-9,下调Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9(P0.05, P0.01)。结论小续命汤有效成分组能够在一定程度上改善局灶性脑缺血再灌注大鼠恢复早期线粒体功能,通过调节Bcl-2家族蛋白和Caspase家族蛋白来减少线粒体相关凋亡蛋白的表达,从而减轻缺血再灌注大鼠大脑神经元的损伤。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R285.5

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