必特螺旋霉素生物合成调控的研究

【摘要】：必特螺旋霉素(Bitespiramycin,BT)已完成Ⅲ期临床试验,4"位的异戊酰化可以增加其组织浓度和体内抗菌活性,延长抗生素的半衰期,临床研究结果表明,对上呼吸道细菌感染具有很好的疗效,且口服剂量低,不良反应少。本文对BT生物合成基因进行深入研究,为提高BT产量提供了重要依据。通过生物信息学分析,从BT产生菌的全基因组序列中得到BT的生物合成基因簇,在基因簇中有4个内源调控基因和一个外源调控基因acyB2,其中orf23和orf42与生二素链霉菌S.ambofaciens中的srm22和srm40基因同源,二者都是螺旋霉素(Spiramycin,SP)生物合成的正调控基因,acyB2与srm40也互为同源基因。对acyB2、srm40和srm22基因在大肠杆菌中进行异源表达研究,只成功表达表达并纯化出Srm22可溶性蛋白,EMSA实验证实Srm22蛋白能与srm40和外源调控基因acyB2的启动区进行结合,却不能与自身启动区以及基因簇内其它结构基因的启动区结合。这说明Srm22不是直接调控结构基因,而是通过调控srm40和acyB2来影响BT的生物合成。通过生物信息分析推测出全局性调控基因:亮氨酸响应蛋白基因(lrp)和光秃家族基因(bldD),两者都参与调控BT的生物合成。在大肠杆菌中表达并纯化出Lrp和BldD蛋白,EMSA实验证实了 Lrp能与acyB2、srm40和srm22的启动区结合,说明Lrp可能对这三个调控基因具有调控作用;而BldD与acyB2、srm22基因的启动区没有特异性结合,说明BldD不直接影响这些调控基因的表达。在发酵培养基中添加L-Leu能明显提高发酵产物中BT的比例,在生物合成途径上L-Leu与BT的异戊酰基侧链合成密切相关。Lrp蛋白参与多个代谢途径的调控,其中包括L-Leu的生物合成,我们删除Lrp的L-Leu结合结构域,希望解除L-Leu生物合成的反馈抑制,增加异戊酰基底物。我们利用HPLC检测SP及BT产量,发现在△lrp-SP变株中,SP总比例由原株的76.3%提高至81.5%,其中SPⅢ产量提高了 88.6%,在Alrp-BT变株中,ISP总比例由原株的17.7%提高至18.9%,其中ISPⅢ产量提高了 212.1%,说明删除Lrp的L-Leu结合结构域能提高SP与BT的产量与组分比例。氨基酸含量结果表明,△lrp-SP变株内BCAAs(Val:32.0μg/g;Leu:37.8μg/g;Ile:13.5 μg/g)比原株内 BCAAs(Val:65.1 μg/g;Leu:62.6 μg/g;Ile:25.1 μg/g)含量低,说明删除Lrp的L-Leu结合结构域能增加菌体内BCAAs的分解代谢。通过转录组分析,我们发现BT和SP生物合成途径,丙氨酸生物合成途径,酰基辅酶A代谢途径等相关基因表达量提高。BT化学结构中含有三个糖基,这些糖基对抑菌活性至关重要,orf21基因(NDP-氨基己糖N二甲基转移酶基因),推测其参与BT左侧糖基福洛氨糖的生物合成,为了证实其功能,我们将orf21基因进行阻断,经过抑菌活性测定证实△orf21基因阻断株的发酵产物中不产生抗菌物质,TLC和HPLC检测证实其不能合成螺旋霉素,但产生一些螺旋霉素类似物,其化学结构正在进行鉴定。