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《北京协和医学院》 2019年
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新型内耳毛细胞时空特异性基因敲除工具Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠的构建和鉴定

唐琦  
【摘要】:研究目的:时空特异性基因敲除是研究小鼠内耳基因功能的重要手段,它可以避免传统基因敲除导致的严重发育畸形和出生后死亡。但现有的内耳毛细胞基因敲除工具多为不可诱导的Cre重组酶,无法对成年小鼠内耳毛细胞基因进行高效的时间特异性敲除。为了更好地实现对成年小鼠内耳毛细胞中基因功能的研究,我们设计构建了新型内耳毛细胞时空特异性基因敲除工具Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠,并对其GCE重组酶的功能进行了鉴定。研究方法:Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠的构建主要采用了胚胎干细胞显微注射的方法,将成功转染的带有Gfi1-P2A-GFP-CreERT2目的基因片段的胚胎干细胞显微注射进E3.5天的小鼠囊胚中,通过胚胎移植的方法移植到代孕母鼠子宫,最后获得Gfi1GEC/Neo嵌合体小鼠。经过多次交配后可得到稳定遗传的Gfi1GCE/+小鼠。通过长距离PCR、免疫荧光染色、耳蜗wholemount染色及听觉脑干反应检测等方法,对Gfi1GCE/+小鼠进行了鉴定。通过对Gfi1GC/+小鼠与Rosa26tdTomato reporter小鼠交配得到的Gfi1GGCE/+;Rosa26tdTmato小鼠进行研究,鉴定了 GCE重组酶的功能并找到了实现Gfi1GC/+GCE重组酶最佳酶切效率的Tamoxifen诱导方案。研究结果:基因型鉴定LR-PCR得到的1.7kb的5'端DNA序列和1.1kb的3'端序列以及使用AcGFP引物鉴定得到的508bp的DNA序列均可证明P2A-GFP-CreERT2 DNA序列被成功插入到小鼠Gfi1第6外显子之后,确定Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠构建成功。Gfi1GCE/+小鼠中GFI1与GFP共表达,且Gfi1基因的表达和功能不受基因重组的影响,即Gfi1GCE/GCE纯合小鼠无听力下降、平衡失调等内耳发育缺陷。在GCE重组酶诱导方案方面,研究明确了对小鼠连续5天腹腔注射Tamoxifen 1mg/次,可实现耳蜗内外毛细胞内基因接近100%的敲除。研究结论:Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠构建成功,可以实现可诱导的内耳毛细胞内基因的高效、时空特异性敲除。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:Q78;R764

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