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《中国协和医科大学》 2006年
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低氧诱导因子-1对肝细胞生长因子基因表达调控机制的研究

苏燕  
【摘要】:目的:第一部分:(1) 观察氯化钴(CoCl_2)及HIF-1α过表达对乳鼠心肌细胞及人宫颈癌Hela细胞存活及凋亡状况的影响。(2) 观察CoCl_2模拟的低氧以及由pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒转染介导的HIF-1α过表达对乳鼠心肌细胞和Hela细胞中HGF/c-Met系统mRNA和蛋白表达的调节。(3)对人HGF基因启动子区进行生物信息学分析,寻找可能介导HGF低氧表达调控的转录因子作用位点。第二部分:根据生物信息学分析结果,在Hela和转染效率较高HEK293细胞中,研究HIF-1α对TGF-β2基因表达调控的作用机制,并进一步观察重组转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)对Hela细胞中HGF表达的影响, 方法:第一部分:(1) 体外培养乳鼠原代心肌细胞和Hela细胞,应用MTT和流式细胞仪检测CoCl_2对乳鼠心肌细胞和Hela细胞存活、增殖及凋亡的影响。(2) 构建pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒(3) 免疫印迹检测CoCl_2和pcDNA3-HIF-1α质粒转染诱导的HIF-1α过表达后,Hela细胞中凋亡相关蛋白Bc1-2和Bax的表达。(4)RT-PCR检测100μmol/L CoCl_2作用6~72h后,心肌细胞中HGF mRNA的表达。(5)Western Blot检测100gmol/L CoCl_2作用心肌细胞12h后HIF-1α蛋白的表达。(6) 相对荧光实时定量PCR检测CoCl_2和pcDNA3-HIF-1α质粒转染后,Hela细胞中HGF/c-Met mRNA的表达。(7) ELISA检测CoCl_2对Hela细胞中分泌性HGF蛋白表达的影响。(8) 利用生物信息学分析人HGF基因启动子区可能的转录因子结合位点。第二部分:(1) 构建pGL3-EPO-HRE荧光素酶报告质粒和pGL3-TGF-β2及其五个突变体的荧光素酶报告质粒。(2) Western Blot和双荧光素酶报告基因法检测CoCl_2和pcDNA3-HIF-1α质粒转染后,Hela和HEK293细胞中HIF-1α蛋白的表达量及其DNA结合活性。(3) 相对荧光实时定量PCR检测250μmol/L CoCl_2单独作用Hela和HEK293细胞6h后,TGF-β2mRNA的表达,以及CoCl_2处理和pcDNA3-HIF-1α质
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R363

【参考文献】
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